Estudio de la contribución de los aminoácidos no excitadores en el edema citotóxico durante la hipoxia

• Autores: Iris Álvarez Merz
• Directores de la Tesis: José María Solís Torralba (dir. tes.), J. M. Hernández Guijo (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2022
• Idioma: español
• Número de páginas: 225
• Tribunal Calificador de la Tesis: Angel Núñez Molina (presid.), Nuria del Olmo Izquierdo (secret.), Alberto Alcázar González (voc.), Andrés Mateo Baraibar Sierra (voc.), Carmen Pérez de Nanclares (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Farmacología y Fisiología por la Universidad Autónoma de Madrid
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Aminoácidos
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen
  • español

    La relación de la excitotoxicidad producida por los aminoácidos excitadores glutamato y aspartato y la isquemia cerebral ha sido extensamente estudiada, aunque poco se sabe acerca del impacto de los aminoácidos no excitadores en esta condición patológica, especialmente en combinación con la hipoxia ocasionada por la interrupción del flujo sanguíneo. Tras una hemorragia cerebral se produce la liberación del contenido plasmático, incluyendo los aminoácidos, al parénquima cerebral. La formación de nuevas hemorragias o la expansión de aquellas preexistentes propaga el daño celular durante horas o días tras los traumatismos craneoencefálicos, en un fenómeno denominado progresión hemorrágica de las contusiones. Además, los aminoácidos liberados en el núcleo isquémico debido a la pérdida de la integridad celular pueden difundir, contribuyendo a la expansión de la región de penumbra en el ictus.

    En este trabajo, hemos empleado rodajas agudas de hipocampo murino para estudiar el efecto de diferentes mezclas de aminoácidos a su concentración plasmática sobre los potenciales de campo provocados, las propiedades básicas de la membrana neuronal y los cambios de volumen celulares, estimados mediante medidas de la resistencia eléctrica del tejido y variaciones en la transmitancia de luz. La microscopía de excitación de dos fotones se ha empleado para cuantificar cambios de volumen de neuronas y astrocitos y la microscopía electrónica de transmisión se ha utilizado para detectar cambios ultraestructurales. El contenido de aminoácidos del tejido se ha determinado mediante técnicas de HPLC.

    Hemos descrito que en condiciones de normoxia, una mezcla formada por siete aminoácidos (AGHQSTU: L-alanina, glicina, L-histidina, L-glutamina, L-serina, L-treonina y taurina a sus concentraciones plasmáticas) provoca un aumento de la amplitud de los potenciales de campo, por un mecanismo independiente de la activación de receptores NMDA y de los transportadores de aminoácidos del sistema A. Esta potenciación se acompaña de un incremento en el contenido de los aminoácidos aplicados en el tejido y de la resistencia eléctrica del tejido, indicando una reducción del volumen del espacio extracelular, aunque sin causar grandes cambios en la resistencia de entrada ni en el potencial de membrana neuronal.

    La pérdida reversible de los potenciales de campo provocada por un periodo de 40 minutos de hipoxia se vuelve completamente irreversible en presencia de la mezcla AGHQSTU, causando paralelamente una intensa despolarización del potencial de membrana neuronal y un fuerte aumento del potencial de fibra presináptico. Además, la presencia de estos aminoácidos durante la hipoxia causa un aumento de la resistencia eléctrica del tejido, indicando una reducción del volumen extracelular. Sin embargo, este efecto no parece deberse únicamente a la acumulación neta de moléculas en las rodajas, indicando la relevancia de la identidad de los aminoácidos aplicados. Así, hemos determinado que una mezcla formada únicamente por cuatro aminoácidos a sus concentraciones plasmáticas (AGQS: L-alanina, glicina, L-glutamina y L-serina) también es capaz de imitar el efecto lesivo de AGHQSTU sobre los potenciales extracelulares provocados durante la hipoxia, sin implicar la activación de los receptores AMPA. Durante la hipoxia, AGQS provoca aumentos de volumen del soma neuronal y astroglial, junto con lesiones irreversibles de las dendritas apicales de las neuronas piramidales. La inhibición de los receptores NMDA impide el desarrollo del daño neuronal en hipoxia, sin afectar el aumento de volumen de los astrocitos hipocampales.

    Empleando inhibidores farmacológicos y sustratos específicos, hemos inferido que el intercambiador ASCT2 (del inglés, alanine-serine-cysteine transporter 2) y los transportadores de aminoácidos del sistema N pueden estar involucrados en el desarrollo de los efectos deletéreos de los aminoácidos durante la hipoxia. Además, la liberación de glutamato, aspartato y D-serina, un co-agonista de los receptores NMDA, mediante la actividad del canal VRAC (del inglés, volume-regulated anion channel) y el intercambiador de aminoácidos Asc-1 (del inglés alanine-serine-cysteine transporter 1) también puede estar involucrada en la pérdida irreversible de los potenciales sinápticos mediada por los aminoácidos en hipoxia.

    Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral indican que los aminoácidos no excitadores también pueden contribuir negativamente al desarrollo y la expansión del daño en patologías como el ictus o el traumatismo craneoencefálico. Los mecanismos que median los efectos adversos producidos por los aminoácidos durante la hipoxia podrían representar nuevas dianas terapéuticas en el tratamiento de la isquemia cerebral.

  • English

    The role of the excitatory amino acids glutamate and aspartate in cerebral ischemia and excitotoxicity has been extensively studied. However, little is known about non excitatory amino acids’ contribution to brain injury, especially in combination with the hypoxia produced when cerebral blood flow is reduced after stroke or brain trauma. After a cerebral hemorrhage, plasmatic content, including amino acids, is released to the brain parenchyma. The generation of new hemorrhages or the expansion of previous ones propagates cell damage hours and days after traumatic brain injury onset, in a phenomenon called hemorrhagic progression of contusions. Furthermore, in focal stroke, amino acids released in the ischemic core from necrotic cells could contribute to penumbra expansion.

    In this work, we have used acute hippocampal murine slices to study the effect of several mixtures of amino acids at their plasmatic concentrations on field evoked potentials, basic neuronal membrane properties and cell volume, estimated by measuring changes in electrical resistance and light transmittance of the slices. Two-photon imaging of neurons and astrocytes is used to quantify changes at the cellular level, while electron microscopy is employed to reveal ultrastructural changes. Slice amino acid content is measured with HPLC techniques.

    We have found that in normoxic conditions, a mixture of seven amino acids (AGHQSTU: L-alanine, glycine, L-histidine, L-glutamine, L-serine, L-threonine, and taurine at their plasmatic concentrations) causes an increase in field potentials’ amplitude, through a mechanism independent of both NMDA receptor activation and amino acid transport system A activity. A concurrent rise in the applied amino acid slice content and electrical tissue resistance indicates a reduction of the extracellular space volume without severely affecting input resistance and neuronal membrane potential.

    The reversible loss of field potentials induced by a 40-minutes hypoxia period becomes irreversible in the presence of AGHQSTU, coinciding with an intense neuronal depolarization and a strong increase in the fiber volley amplitude. Moreover, the presence of the amino acids during hypoxia causes a rise in the electrical tissue resistance, indicating a reduction of the extracellular volume. Nevertheless, only specific amino acids cause these irreversible effects during hypoxia, suggesting that it cannot be entirely explained by the sole increase in the number of particles accumulated in the tissue, and that the identity of the amino acids determines their effect. A mixture of only four amino acids at their plasmatic concentrations (AGQS: L-alanine, glycine, L-glutamine, and L serine) mimics the AGHQSTU-induced deleterious effects on extracellular evoked potentials during hypoxia, without involving the activation of AMPA receptors. During hypoxia, AGQS causes neuronal and astroglial soma swelling, alongside irreversible dendritic damage. NMDA receptor blockade prevents hypoxic neuronal damage without affecting the increase in astroglial volume.

    ASCT2 (alanine-serine-cysteine transporter 2) exchanger and system N amino acid transporters could be involved in the amino acids-induced hypoxic damage, as inferred by the use of pharmacological inhibitors and specific substrates. Moreover, VRAC (volume-regulated anion channel) and Asc-1 (alanine-serine-cysteine transporter 1)-dependent release of glutamate, aspartate, and D-serine, an NMDA receptor co-agonist, could also be related to the irreversible loss of synaptic potentials mediated by amino acids in hypoxia.

    Results obtained in this Ph.D. Thesis imply that non-excitatory amino acids contribute to development and expansion of brain damage in neurological emergencies such as stroke and traumatic brain injury. Mechanisms mediating adverse effects of non-excitatory amino acids during hypoxia could point to novel therapeutic targets to ameliorate brain ischemia.