Procesos moleculares implicados en los pasos iniciales de la síntesis de los ribosomas humanos

• Autores: Sonia Gómez Gaspar
• Directores de la Tesis: Mercedes Dosil Castro (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Salamanca ( España ) en 2022
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Jesús de la Cruz Díaz (presid.), Sandra Blanco Benavente (secret.), José Carlos Reyes Rosa (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biociencias: Biología y Clínica del Cáncer y Medicina Traslacional por la Universidad de Salamanca
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: GREDOS
• Resumen
  • español

    La síntesis de ribosomas es un proceso complejo en el que la transcripción, modificación, plegamiento y procesamiento del precursor del rRNA (pre-rRNA) se tienen que coordinar para dar lugar a la formación de las subunidades ribosómicas maduras. Este proceso es asistido por más de 200 factores de biogénesis de ribosomas (RBFs) que, junto con el pre-rRNA y las proteínas ribosómicas, van conformando diferentes complejos pre-ribosómicos. Estos complejos migran desde el nucleolo al citoplasma a medida que van madurando. En células humanas, la información disponible acerca de la composición de los pre-ribosomas, sobre todo la que se refiere a aquellos que son nucleolares y más iniciales, es muy escasa debido a que existen limitaciones técnicas para poder analizarlos bioquímicamente. Esto se debe a que las partículas pre-ribosómicas más tempranas son producidas en regiones internas del nucleolo que tienen una alta viscosidad, lo cual dificulta su extracción. La primera parte de esta tesis se centra en la generación de herramientas y el desarrollo de métodos de extracción que permitan caracterizar a los pre-ribosomas nucleolares tempranos de células humanas. Primero, se realizó una validación del método de extracción PSE y se generaron líneas celulares que expresan endógenamente un RBF fusionado a la GFP, para utilizarlo como cebo de purificación de pre-ribosomas tempranos por cromatografía de afinidad. Seguidamente, utilizando esas herramientas en combinación con análisis composicionales por espectrometría de masas y experimentos de sedimentación en gradientes de sacarosa, se comprobó que la composición del subcomplejo pre-ribosómico UTP-B y que la función de la proteína UTP14A están conservados en células humanas y células de levadura. En la segunda parte de la tesis se realizó un estudio de caracterización funcional de la proteína RRP8, la metiltransferasa que introduce la modificación m1A1322 en el rRNA 28S. La identificación de RBFs que interaccionan con RRP8 y la caracterización del fenotipo inducido por su silenciamiento o eliminación total evidenciaron que esta proteína forma un módulo con un RBF de la subunidad 40S que se une y es importante para la producción eficiente del pre-ribosoma bipartito, el intermediario inicial que contiene todavía unidos los precursores prematuros de la subunidad pequeña y de la subunidad grande. Aunque la pérdida de RRP8 es bien tolerada por células transformadas en cultivo, no lo es en células no transformadas, lo cual revela que su función es esencial en algunos tipos celulares.

  • English

    Ribosome synthesis is an intricate process during which the transcription, modification, folding, and processing of the rRNA precursors (pre-rRNAs) are coordinated to build mature ribosome subunits. This process is driven by more than 200 ribosome biogenesis factors (RBFs) that, together with the pre-rRNAs and ribosomal proteins, form different preribosomal complexes. These complexes migrate from the nucleolus to the cytoplasm as they mature. The composition and structure of preribosomes in human cells are ill-defined and, in the case of those formed in the most internal regions of the nucleolus, this is caused by technical limitations. The main reason for those limitations is that the highly viscous nature of the inner regions of the nucleolus precludes the extraction of the complexes. The first part of this thesis is focused on the generation of tools and the development of extraction methods to characterize early nucleolar preribosomes in human cells. The initial studies were the validation of the PSE extraction method to isolate early preribosomes and the generation of cell lines that endogenously express an early RBF fused to GFP to be used as bait for preribosome purification by affinity chromatography. Using these tools, and a combination of mass-spectrometry compositional analysis and sucrose-gradient sedimentation experiments, it was found that the composition of the preribosomal subcomplex UTP-B and the function of the UTP14A protein are conserved in humans and yeast. The second part of the thesis was devoted to the functional characterization of RRP8, a methyltransferase responsible for the m1A1322 modification in the 28S rRNA. The identification of RBFs that interact with RRP8 and the characterization of the RRP8 knockout phenotype unveiled that this protein forms a module with one 40S subunit RBF that binds to the bipartite preribosome, the initial intermediate that contains the primordial precursors of both the small and large subunits. The RRP8 module is required for the efficient formation of bipartite preribosomes. The complete loss of RRP8 is well tolerated by transformed cell lines, but not by non-transformed cells indicating that its function is essential for the viability of some cell types.