Caracterización estructural y funcional de proteínas quinasas C y su interacción con proteínas moduladoras y sustratos
- Autores: Jesús Baltanás Copado
- Directores de la Tesis: Juan Carmelo Gómez Fernández (dir. tes.), Senena Corbalán García (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Murcia ( España ) en 2022
- Idioma: español
- Número de páginas: 428
- Tribunal Calificador de la Tesis: Consuelo Marín-Vicente (presid.), Fernando Soler Pardo (secret.), José Antonio Valverde López (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Molecular y Biotecnología por la Universidad de Murcia
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: DIGITUM
- Resumen
- español
En la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo el análisis biofísico y estructural de importantes proteínas pertenecientes a la familia de las quinasas PKCs. Además, también se ha relacionado el estudio con proteínas con las que interaccionan, Fascin1, un importante sustrato de PKCα con un papel fundamental en la dinámica espaciotemporal dentro del citoesqueleto de F-actina y, por otra parte, una proteína con un papel fundamental en la localización celular en membrana de las PKCs, RACK1. Todo ello en conjunto con diversas combinaciones de aditivos (CaCl2, el éster de forbol P13A, ADP y MgCl2), que tienen importancia modulando la actividad de estas quinasas. Por medio de técnicas de cristalografía de rayos X y criomicroscopía electrónica, se realizó un amplio estudio de cribados de cristalización y preparación de rejillas de CryoEM para las quinasas PKCs junto con las proteínas moduladoras y sustratos anteriormente mencionados. Desafortunadamente, no se obtuvieron cristales con la presencia de alguna de las PKCs objeto de estudio ni datos por medio de CryoEM que permitiera la determinación estructural atómica o casi atómica de las proteínas PKCs. No obstante, a través de CryoEM conseguimos determinar condiciones preliminares, que resultaron en clasificaciones 2D en las que podíamos interpretar un posible modelo de interacción para el complejo PKCα-Fascin1 y con un gran potencial de poder determinar estructuralmente a nivel atómico dicho complejo mediante la mejora de la toma de datos inicial. También se realizaron diversas técnicas biofísicas tales como Thermal Shift Assay que permitieron inferir modos de unión diferentes para PKCα y Fascin1 dependiendo de la combinación de aditivos añadidos al medio. Por medio de SPR también se determinó que la mayor afinidad entre Fascin1 y PKCα se producía con la versión silvestre de Fascin1 junto con todos los aditivos que se probaron (CaCl2, el éster de forbol P13A y ADP-MgCl2). Estudios de tomografía por medio de CryoEM permitieron determinar la unión de Fascin1 a los filamentos de F-actina de forma discreta mediante el empleo de un mutante de Fascin1 que afecta a uno de los dos sitios principales de interacción con F-actina. En la actualidad, el proyecto se encuentra en una fase avanzada previa a la determinación estructural atómica de dicha interacción. Por otra parte, también se realizaron ensayos de rescate de fármacos que fueran capaces de interaccionar con el bolsillo de unión a PIP2 del dominio C2 de PKCα y que pudiera tener algún efecto en la capacidad de la quinasa en reconocer la membrana. Sin embargo, después de realizar ensayos biofísicos de FRET y sedimentación lipídica, así como ensayos celulares acoplados a microscopía confocal, no se consiguió asignar a ninguno de los fármacos un papel interfiriendo en la habilidad de la proteína reconociendo la membrana. No obstante, por medio de cristalografía de rayos X se determinó que uno de los compuestos estudiados era capaz de interaccionar con el bolsillo de unión al fosfoinosítido PIP2. A pesar de los enormes retos estructurales que presentan estas proteínas PKCs (asimetría, pequeño tamaño y la capacidad de adoptar múltiples conformaciones haciendo de ellas proteínas muy flexibles) y que hacen que hasta la fecha no haya información estructural completa para ninguna de sus isoformas, se ha conseguido obtener información de gran valor y con potencial de poder avanzar con el estudio estructural para acercarnos a la resolución atómica del complejo PKCα-Fascin1. Esto podría ayudar a resolver el gran problema que existe hoy día en el desarrollo de fármacos específicos de diana para esta familia de quinasas y así poder luchar contra el cáncer, una de las principales enfermedades en las que las proteínas PKCs se encuentran involucradas.
- English
In the present Doctoral Thesis, the biophysical and structural analysis of important proteins belonging to the PKC kinase family has been carried out. In addition, the study has also been related to proteins with which they interact, Fascin1, an important substrate of PKCα with a fundamental role in the spatiotemporal dynamics within the F-actin cytoskeleton and, on the other hand, a protein with a paramount role in the cellular localization in the membrane of PKCs, RACK1. All of this in conjunction with various combinations of additives (CaCl2, the phorbol ester P13A and ADP-MgCl2), which are important in modulating the activity of these kinases. By means of X-ray crystallography and cryo-electron microscopy techniques, an extensive study of crystallization screenings and preparation of CryoEM grids for PKCs kinases together with the modulatory proteins and substrates was performed. Unfortunately, no crystals were obtained with the presence of any of the PKCs under study neither information by CryoEM that would allow atomic or near-atomic structural determination of the PKCs proteins. Nevertheless, through CryoEM we managed to determine preliminary conditions, resulting in 2D classifications in which we could interpret a possible interaction model for the PKCα-Fascin1 complex. Thus, with a great potential to be able to structurally determine the protein complex by improving the initial data acquisition. We also performed several biophysical techniques such as Thermal Shift Assay that allowed us to infer different binding modes for PKCα and Fascin1 depending on the combination of additives added to the medium. By SPR, it was also determined that the highest affinity between Fascin1 and PKCα occurred with the wild-type version of Fascin1 together with all the additives tested (CaCl2, the phorbol ester P13A and ADP-MgCl2). Cryo-electron microscopy tomography studies allowed us to determine the binding of Fascin1 to F-actin filaments in a discrete manner by using a Fascin1 mutant affecting one of the two main sites of interaction with F-actin. The project is currently at an advanced stage prior to the atomic structural determination of this interaction. On the other hand, drug rescue assays were also carried out for pharmacological substances that could be able to interact with the PIP2-binding pocket of the C2 domain of PKCα and that could influence the ability of the kinase to recognize the membrane. However, after performing biophysical assays such as FRET and lipid sedimentation assays, as well as cellular assays coupled to confocal microscopy, none of the drugs under study could be assigned with a role in disrupting the ability of the protein recognizing the membrane. However, by X-ray crystallography it was determined that one of the compounds under study was able to interact with the PIP2 binding pocket. Despite the enormous structural challenges presented by these PKC proteins (asymmetry, small size and the ability to adopt multiple conformations making them very flexible proteins) and the fact that to date there is no complete structural information for any of their isoforms, it has been possible to obtain highly valuable information with the potential to advance in the structural determination at an atomic resolution for the protein complex PKCα-Fascin1. This could help to overcome the big issue that exists today in the development of specific drugs for this family of kinases and thus be able to fight cancer, one of the main diseases in which PKC proteins are involved.
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