Dinámica de la acetilación de "Escherichia coli" para mejorar sus capacidades biotecnológicas
- Autores: G. Lozano Terol
- Directores de la Tesis: Teresa de Diego Puente (dir. tes.), Manuel Cánovas Díaz (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Murcia ( España ) en 2022
- Idioma: español
- Número de páginas: 266
- Tribunal Calificador de la Tesis: José María Obón de Castro (presid.), Álvaro Ortega Retuerta (secret.), Sara Castaño Cerezo (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Química Básica y Aplicada por la Universidad de Murcia
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: DIGITUM
- Resumen
- español
E. coli es uno de los microorganismos más utilizados con fines biotecnológicos y como modelo de investigación, pues ha sido ampliamente estudiado y se conoce su genoma completo, así como su proteoma y transcriptoma. Sin embargo, el uso de E. coli como organismo huésped en bioprocesos (producción de proteínas recombinantes) puede conllevar una serie de inconvenientes, como la carga metabólica, el desbordamiento del acetato y el conocimiento limitado de algunas de sus modificaciones postraduccionales, como la acetilación de lisinas. La Nε-acetilación de las lisinas es una modificación postraduccional que está relacionada con el metabolismo del acetato a través de los intermediarios acetil-CoA y acetil-P, que actúan como dadores de acetilos. Esta modificación se produce en muchas enzimas del metabolismo central y está implicada en la regulación de los procesos metabólicos, los procesos de traducción, la localización celular y las interacciones de las proteínas con otras moléculas. El principal objetivo de esta Tesis Doctoral fue comprender los factores que gobiernan la dinámica de la acetilación de proteínas y su efecto sobre el control del metabolismo central de E. coli, con el fin de diseñar estrategias que garanticen la optimización celular para la producción de proteínas recombinantes. Así, se estudiaron las implicaciones del uso de distintos medios de cultivo en la producción de proteínas recombinantes, y en el perfil proteico y el nivel de acetilación en E. coli (Capítulos 3 y 6). Además, también se emplearon distintos sistemas de expresión y cepas deficientes en genes involucrados en el metabolismo del acetato y en la acetilación de lisinas, para optimizar la producción de proteínas recombinantes y conocer su nivel de acetilación (Capítulos 3 y 4). Por último, se estudiaron las implicaciones de la acetilación en una importante ruta metabólica, la ruta de biosíntesis de pirimidinas de novo (Capítulo 5). Los resultados obtenidos permitirán diseñar estrategias racionales, tanto por ingeniería de cepas como por la selección de medios de cultivo, para aumentar las capacidades biotecnológicas de la bacteria y conocer las implicaciones de la acetilación en estos procesos. A partir de los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral, las principales conclusiones extraídas son: 1) La producción de proteínas recombinantes se ve favorecida utilizando un medio complejo y glicerol como fuente de carbono. 2) La utilización de la cepa ΔackA supone una reducción en el desbordamiento del acetato y un aumento de 5 veces en la producción de proteínas recombinantes cuando se emplea el sistema de expresión óptimo. 3) La carga metabólica producida por la transcripción de los vectores de expresión conduce a una disminución de la producción de proteínas recombinantes cuando se emplean sistemas de expresión de alto número de copias con promotores fuertes. 4) La ruta de biosíntesis de pirimidinas de novo es regulada por la acetilación de lisinas en la enzima OPRTasa. La acetilación de la OPRTasa en las lisinas 26 y 103 produce una disminución de la actividad que puede ser revertida por la desacetilasa CobB. 5) La abundancia relativa de proteínas en E. coli depende de las condiciones de cultivo, y la identidad y el número de lisinas acetiladas depende de la abundancia relativa de las proteínas. 6) El nivel de acetilación en E. coli depende principalmente del desbordamiento de acetato, siendo mayor en medio complejo. 7) Se han encontrado lisinas con diferencias en su nivel de acetilación entre las distintas condiciones de cultivo en el ciclo del glioxilato, el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y la asimilación del nitrógeno, por lo que estas vías podrían estar reguladas por acetilación de forma diferencial. En conclusión, los resultados de esta Tesis Doctoral ponen de manifiesto la interconexión de la regulación por acetilación de las rutas del metabolismo central con las condiciones de cultivo en E. coli. Por lo tanto, el empleo de distintas condiciones de cultivo determina los flujos del metabolismo central en general, y en concreto del desbordamiento del acetato, lo que tiene repercusiones en la abundancia relativa de las proteínas, en el nivel de acetilación de lisinas y, en consecuencia, en la producción de proteínas recombinantes.
- English
E. coli is one of the most widely used microorganisms for biotechnological purposes and as a research model, as it has been extensively studied and its complete genome, proteome and transcriptome are known. However, the use of E. coli as a host organism in bioprocesses (recombinant protein production) can lead to several drawbacks, such as metabolic burden, acetate overflow and limited knowledge of some of its posttranslational modifications, such as lysine acetylation. Nε-acetylation of lysines is a posttranslational modification that is related to acetate metabolism via acetyl-CoA and acetyl-P intermediates, which act as acetyl donors. This modification occurs in many enzymes of central metabolism and is involved in the regulation of metabolic processes, translation processes, cellular localisation and interactions of proteins with other molecules. The main objective of this PhD Thesis was to understand the factors that govern the dynamics of protein acetylation and its effect on the control of central metabolism in E. coli, in order to design strategies that guarantee cell optimisation to produce recombinant proteins. Thus, the implications of the use of different culture media on the production of recombinant proteins, and on the protein profile and acetylation level in E. coli were studied (Chapters 3 and 6). In addition, different expression systems and deficient strains in genes involved in acetate metabolism and lysine acetylation were also used to optimise the production of recombinant proteins and to determine their acetylation level (Chapters 3 and 4). Finally, the implications of acetylation in an important metabolic pathway, the de novo pyrimidine biosynthesis pathway, were studied (Chapter 5). The results obtained will allow the design of rational strategies, both by strain engineering and culture media selection, to increase the biotechnological capabilities of the bacteria and to understand the implications of acetylation in these processes. From the results obtained in this PhD Thesis, the main conclusions drawn are: 1) The production of recombinant proteins is favoured by using a complex medium and glycerol as a carbon source. 2) The use of the ΔackA strain results in a reduction in acetate overflow and a 5-fold increase in recombinant protein production when the optimal expression system is employed. 3) The metabolic burden produced by transcription of expression vectors leads to a decrease in recombinant protein production when using high copy number expression systems with strong promoters. 4) The de novo pyrimidine biosynthesis pathway is regulated by the acetylation of lysines in the OPRTase enzyme. Acetylation of OPRTase at lysines 26 and 103 results in a decrease in activity that can be reversed by CobB deacetylase. 5) The relative abundance of proteins in E. coli depends on culture conditions, and the identity and number of acetylated lysines depends on the relative abundance of proteins. 6) The level of acetylation in E. coli depends mainly on acetate overflow, being higher in complex medium. 7) Lysines with differences in their level of acetylation between culture conditions have been found in the glyoxylate cycle, the tricarboxylic acid cycle and nitrogen assimilation, so these pathways could be differentially regulated by acetylation. In conclusion, the results of this PhD Thesis show the interconnection of acetylation regulation of central metabolic pathways with culture conditions in E. coli. Thus, the use of different culture conditions determines the fluxes of central metabolism in general, and specifically of acetate overflow, which has an impact on the relative abundance of proteins, the level of lysine acetylation and, consequently, the production of recombinant proteins.
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