Multivalent tryptophan derivatives able to prevent Human Immunodeficiency Virus (HIV) and Enterovirus A71 (EV-A71) infections
- Autores: Olaia Martí Marí
- Directores de la Tesis: Ana Rosa San Félix (dir. tes.), María José Camarasa Ríus (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2022
- Idioma: inglés
- Número de páginas: 273
- Títulos paralelos:
- Derivados multivalentes de triptófano capaces de prevenir las infecciones del Virus de Inmunodeficiencia Humana (HIV) y Enterovirus A71 (EV-A71)
- Tribunal Calificador de la Tesis: Vincenzo Summa (presid.), José Julián Alemán Lara (secret.), María del Rosario González Muñiz (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Química Orgánica por la Universidad Autónoma de Madrid
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
- Resumen
Hasta el momento tan solo hay cuatro fármacos que inhiben la entrada-fusión del Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) en la célula huésped aprobados por la FDA. La situación es aún peor para el Enterovirus 71 (EV71) para el que no se dispone de ningún tipo de terapia.
La glicoproteína gp120 de la envoltura del VIH-1 es crucial para la entrada de dicho virus en la célula huésped ya que es el primer punto de contacto con el receptor celular CD4 antes de que el VIH-1 se una a los correceptores de quimiocinas, CCR5 o CXCR4. Asimismo, la glicoproteína gp120 desempeña un papel importante en la etapa de fusión de las membranas viral y celular.
Previamente, en nuestro grupo de investigación se sintetizó una familia de dendrímeros de triptófano (Trp), que inhiben una etapa temprana del ciclo de vida del VIH al interaccionar con la glicoproteína gp120 de la envoltura viral. Curiosamente, estos compuestos también resultaron ser potentes inhibidores de la replicación del Enterovirus A71 (EV-A71), el virus responsable de la mayoría de las formas graves del denominado síndrome de mano, pie y boca (HFMD, por sus siglas en inglés).
El prototipo de esta familia es el dendrímero AL-385, un derivado de pentaeritritol con 12 residuos de Trp en la periferia. AL-385 inhibe a nivel submicromolar la cepa de laboratorio de EV-A71 (BrCr), y además diferentes cepas clínicas aisladas de pacientes (pertenecientes a distintos subgenogrupos) en el rango nanomolar bajo/picomolar. Estudios biológicos demostraron que AL-385 inhibe una etapa temprana del ciclo infeccioso del EV-A71 interaccionando con aminoácidos de la proteína viral VP1, particularmente la región cargada positivamente situada alrededor del eje C-5 de la cápsida viral. De este modo la unión del virus a la célula huésped queda bloqueada y la infección no progresa.
Tomando como prototipo AL-385 se realizaron modificaciones tanto en el núcleo central como en los brazos y la periferia. Dichas modificaciones permitieron concluir que se requiere la presencia de múltiples residuos de Trp, con su respectiva cadena lateral de indol y ácidos carboxílicos libres, para observar actividad antiviral tanto frente a VIH como frente a EV-A71.
Aplicando una estrategia de simplificación de “scaffold”, se sintetizaron derivados de Trp de menor tamaño. Los prototipos de esta nueva familia, AL-470 y AL-471, constan en su estructura de un “scaffold” central al que se le unen tres o cuatro residuos de Trp portadores en la posición C-2 de la cadena lateral del indol de un residuo de ácido isoftálico (benceno 1,3-dicarboxílico; IPA por su nombre en inglés). Dichos compuestos resultaron ser más potentes que el dendrímero AL-385 frente a VIH y EV-A71, mientras que resultaron poco tóxicos para la célula huésped.
Estudios biológicos para determinar el mecanismo de acción de AL-470 y AL-471 concluyeron que, al igual que el dendrímero AL-385, actúan como inhibidores de entrada uniéndose tanto a la glicoproteína gp120 del VIH como a la región cargada positivamente situada alrededor del eje C-5 de la cápsida de EV-A71.
En la presente Tesis doctoral se sintetizaron derivados de los prototipos AL-470 y AL-471 con el fin de analizar la relación estructura-actividad (SAR en inglés) y determinar los aspectos estructurales necesarios para la actividad anti-VIH y anti-EV71.
• Capítulo 1 En primer lugar, se estudió la influencia de la estereoquímica del residuo de Trp en la actividad antiviral. Con este objetivo, se sintetizó el isómero D del prototipo AL-471.
Además, para completar el análisis SAR en la posición C-2, se sintetizaron derivados de Trp alquilados en C-2 con cadenas de tres, cinco y ocho metilenos que presentan un ácido isoftálico terminal. De manera similar, también se introdujeron en la posición C-2 cadenas de ácido butanoico y heptanoico.
Por otra parte, se sintetizaron compuestos en los que cuatro residuos de ácido isoftálico se unieron directamente o mediante un espaciador metilénico a un “scaffold” central tetrapodal. De esta manera, se eliminó el fragmento de Trp acortándose sustancialmente la ruta sintética.
Nuestro análisis SAR mostró claramente que la estereoquímica del aminoácido (Trp) no es decisiva para la actividad antiviral. Además, se confirmó que el elemento estructural esencial para la actividad antiviral (farmacóforo) es el ácido isoftálico (benceno 1,3-dicarboxilico) directamente unido a la posición C-2 del anillo de indol (cadena lateral del Trp). Un espaciador flexible conectando ambas subunidades o un ácido monocarboxílico terminal condujeron a compuestos inactivos. Finalmente, los análogos truncados en los que se unieron cuatro grupos de ácido isoftálico, bien directamente o mediante un espaciador dimetílénico al “scaffold” central, resultaron inactivos (VIH) o considerablemente menos potentes (EV-A71) que el prototipo AL-471, poniendo de manifiesto la importancia del fragmento de Trp para la actividad.
• Capítulo 2 Con el fin de enriquecer el análisis SAR, se realizaron modificaciones estructurales en el punto focal de AL-470. Para ello fue crucial la sustitución del grupo nitro inerte presente en AL-470 por un grupo amino reactivo. En consecuencia, en primer lugar, se sintetizó el compuesto OMe NH2 dendrón con un grupo amino libre en el punto focal que resultó un intermedio sintético clave.
A continuación, se unió al amino libre del punto focal, bien directamente o mediante un espaciador flexible de diferente longitud, una primera serie de anillos aromáticos (ácido isoftálico, naftilo, ácido 3-benzoico, 9H-fluorenilo).
Los resultados biológicos demostraron que el punto focal tolera la conjugación con diferentes tipos de anillos aromáticos sin pérdida de actividad antiviral. Este resultado llevó a utilizar dicha posición para marcar la molécula con una sonda fluorescente (Alexa fluor® 647).
La molécula fluorescente resultante (en forma de sal sódica) se empleó para realizar estudios de biodistribución y acumulación en los tejidos. Para ello la molécula se inyectó por vía intravenosa (i.v) e intraperitoneal (i.p) en ratones sanos. Los resultados obtenidos demostraron que esta clase de compuestos es capaz de llegar a los pulmones, estómago e intestino, principales lugares de replicación de EV-A71.
Además, basándose en trabajos publicados que demostraban que un residuo de nitroareno (2,4-dinitrofenilo, DNP) es capaz de reclutar anticuerpos endógenos contra las células infectadas por el VIH, se decidió sintetizar conjugados en los que dicho anillo aromático está unido al punto focal. Nuestra hipótesis es que la interacción de la molécula bifuncional resultante con la glicoproteína gp120 de la envoltura del VIH puede desencadenar una respuesta inmune celular que podría ayudar a eliminar el VIH o la célula infectada. El trabajo experimental para demostrar tal hipótesis ya ha sido iniciado.
• Capítulo 3 Con el fin de completar nuestro análisis SAR, se utilizaron otras posiciones del anillo de indol diferentes a C-2 o N-1 (estudiadas previamente) para introducir el anillo crucial de ácido isoftálico. Más en concreto se exploró la posición C-7 y se sintetizaron trímeros y tetrámeros doblemente arilados en las posiciones C-2/C-7 del indol investigando la repercusión de dichas modificaciones estructurales en la actividad anti-VIH y anti-EV71.
Como resultado de este trabajo hemos obtenido el compuesto AL-518, que constituye el inhibidor de entrada más potente de los sintetizados hasta el momento en nuestro grupo de investigación (CE50 VIH-1: 6 nM; CE50 EV-A71: 40 nM). Dicho compuesto es un derivado tetrapodal de Trp doblemente arilado con residuos de ácido isoftálico en las posiciones C-2 y C-7 de cada anillo de indol. Estudios de Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) mostraron que la afinidad de AL-518 por gp120 es mayor (KD más pequeña) que la del prototipo monoarilado en C-2 (AL-471) lo que concuerda con su mayor actividad anti-VIH-1. Además, AL-518 inhibe con eficacia similar las cepas virales con tropismo para X4 y R5 lo que indica que su sitio de unión en gp120 está bastante conservado. Además, los experimentos de competición con anticuerpos monoclonales (mAb, del inglés monoclonal antibody) dirigidos a regiones específicas del loop V3 de gp120 sugieren que el sitio de unión de AL-518 se superpone con el de los epítopos que reconocen los mAbs 447-52D y 9284 (vértice superior y extremo aminoterminal del loop V3 de gp120).
Con respecto a EV-A71, estudios de modelado molecular mostraron que AL-518 interacciona con la proteína viral VP1 de manera similar al prototipo AL-471. El residuo de Trp se aloja en la interfaz entre dos monómeros de VP1. El anillo de indol del Trp y los residuos de ácido isoftálico establecen múltiples enlaces de hidrógeno, así como interacciones CH×××π y electrostáticas con diferentes residuos de dicha región de la cápsida viral. Nuestra hipótesis es que la unión de AL-518 a la cápsida viral impide la interacción del EV-A71 con sus (co-) receptores celulares, ligando 1 de la glicoproteína P-selectina (PSGL-1) y heparán sulfato (HS), y como consecuencia la infección viral queda bloqueada.
En resumen, el compuesto AL-518, descubierto en esta tesis doctoral, es un potente inhibidor de entrada de VIH-1 y EV-A71 en la célula huésped que ejerce su acción uniéndose a la respectiva superficie viral (glicoproteína gp120 del VIH y eje C-5 de la cápsida del EV-A71). Su elevada potencia antiviral y baja toxicidad, así como su facilidad sintética y posibilidad de modificación química convierten a dicho compuesto en un nuevo prototipo de gran utilidad con el que pretendemos seguir trabajando.
