Proteínas quimera de los dominios SH3 de la c-Src y Abl tirosina quinasa: un estudio de las bases moleculares del entrecruzamiento tridimensional de dominios
- Autores: María del Carmen Salinas García
- Directores de la Tesis: Ana María Cámara Artigas (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Almería ( España ) en 2022
- Idioma: español
- Títulos paralelos:
- Chimeric proteins from the SH3 domains of the c-Src and Abl tyrosine kinase: a study of the molecular bases of 3D-domain swapping
- Tribunal Calificador de la Tesis: Jose Antonio Gavira Gallardo (presid.), E. Ortiz Salmerón (secret.), Bertrand Morel (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Química Avanzada por la Universidad de Almería
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: riUAL
- Resumen
- español
El principal objetivo de esta Tesis doctoral es el estudio de procesos de plegamiento alternativo que sufren algunas proteínas. Entre estos se encuentran el entrecruzamiento de dominios y la formación de fibras amiloides. En esta Tesis nos hemos centrado en una proteína modelo para poder desarrollar estos estudios como es el dominio SH3 de la c-Src tirosina quinasa. Nuestros estudios se han centrado principalmente en el papel del llamado lazo bisagra en la apertura de los dominios para formar los oligómeros entrecruzados. Se han intercambiado dos de los lazos del dominio SH3 que, además de realizar un papel clave en la función del dominio, son susceptibles de sufrir la apertura. De esta forma, se han construido proteínas quimeras del dominio c-Src-SH3 y Abl-SH3 en los que se han intercambiado los lazos RT y n-Src de forma independiente o simultánea. Se ha seleccionado el dominio SH3 de la Abl porque en este ni se ha descrito la formación de fibras amiloides ni la de oligómeros entrecruzados y, además, presenta una composición de los lazos con cambios en residuos importantes para la estabilización el dímero entrecruzado del domino c-Src SH3. También se ha estudiado el efecto de las mutaciones oncogénicas del dominio SH3 de la variante viral de la c-Src tirosina quinasa, la v-Src, que aparecen precisamente en los lazos intercambiados.
Se ha llevado a cabo un estudio estructural y la caracterización biofísica de todas las proteínas objeto de estudio. Los resultados obtenidos en esta Tesis demuestran que, al menos en el caso del dominio c-Src SH3, existen otros factores que facilitan la formación de dímeros entrecruzados, más allá de la composición del lazo. En efecto, la sustitución de los lazos RT y n-Src del dominio Abl da lugar a un dímero entrecruzado en el cual los dos lazos actúan como lazo bisagra. En todas las condiciones estudiadas no se ha logrado la formación de dímeros entrecruzados de las quimeras Abl con los lazos del dominio c-Src. La caracterización biofísica demuestra que mientras la sustitución de los lazos de la Abl en el domino c-Src apenas producen cambios en la estabilidad del dominio, el efecto es mucho más notable en las quimeras del domino Abl en la que se han introducido los lazos del dominio c-Src-SH3. En cuanto a la formación de fibras amiloides, hemos corroborado la presencia de estos en aquellos dominios que se han obtenido como dímeros entrecruzados.
Son de especial interés los resultados obtenidos con la variante oncogénica del dominio c-Src SH3. La formación del dímero entrecruzado solo se ha obtenido en la proteína que contiene las mutaciones en el lazo n-Src, pero no en el lazo RT. Se han obtenido las estructuras de tres variantes de este dominio que permiten analizar la pérdida de estabilidad de este dominio mientras conserva la capacidad de unir secuencias ricas en prolina. En este dominio la mutación de Arg95Trp conduce a la pérdida de un puente salino que es clave para estabilizar el dímero entrecruzado. Además, la presencia del Trp95 en el lazo hace la proteína más inestable y susceptible de agregarse formando fibras amiloides.
- English
This doctoral thesis investigates the molecular principles of protein misfolding, like threedimensional domain-swapping or amyloid formation. For this purpose, we have used a model protein as it is the SH3 domain of the c-Src tyrosine kinase.
Our studies were mainly focused on the role of the so-called hinge loop, which is the region of the protein susceptible to opening to facilitate the formation of the intertwined oligomers. Two of the loops, the RT and n-Src loops, have been interchanged between c-Src-SH3 and Abl-SH3 domains. Abl has been selected because neither formation of amyloid fibres nor intertwined oligomers have been described in its SH3 domain. In addition, these loops play a key role in the domain function, and their composition is different in crucial residues in stabilising the intertwined dimer of the c-Src-SH3. In this way, chimeric proteins of the c-Src-SH3 and Abl- SH3 domains have been constructed, introducing the RT or the n-Src loops, or both loops simultaneously. We have also studied the effect of oncogenic mutations in the SH3 domain of the viral variant of c-Src tyrosine kinase, v-Src. These mutations appear precisely in the exchanged loops.
We have carried out a structural study and biophysical characterisation of all the designed chimeric proteins and the v-Src mutants. The results obtained in this thesis show that, at least in the case of the c-Src SH3 domain, other factors beyond the composition of the hinge loop facilitate the formation of intertwined dimers. Indeed, the substitution of the RT and n-Src loops of the Abl domain gives rise to an intertwined dimer in which the two loops act as hinge loops. In all the conditions studied, Abl chimeras with the loops of the c-Src domain do not form intertwined dimers. The biophysical characterisation shows that the substitution of the Abl loops in the c-Src-SH3 domain barely produces any changes in the stability of the domain.
This effect is much more notable in the chimeras of the Abl domain in which the c-Src domain loops have been introduced. Regarding the formation of amyloid fibres, these are formed by those chimeras obtained as intertwined dimers.
The results obtained with the oncogenic variant of the c-Src SH3 domain are quite interesting.
Formation of the intertwined dimer takes only place in the protein that contains the mutations in the n-Src and distal loops, but not in the RT loop. The structures of three variants of this domain have been obtained. These structures show that although the viral SH3 domain is less stable, this domain can bind sequences rich in proline. In this domain, the mutation of Arg95Trp leads to the loss of a salt bridge that is key to stabilising the intertwined dimer. Furthermore, the presence of Trp95 in the loop makes the protein more unstable and susceptible to aggregation forming amyloid fibres
- español
