Cultivos primarios de osteoblastos humanos. Sistema OPG/RANKL. Efecto de estímulos hormonales y fármacos antiresortivos
- Autores: María José Ríos Moreno
- Directores de la Tesis: Ramón Pérez Cano (dir. tes.), María-José Montoya-García (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2009
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Federico Hawkins Carranza (presid.), José Manuel Quesada Gómez (secret.), José Luis Torrella López (voc.), Rosa María Moruno García (voc.), María Ángeles Vázquez Gámez (voc.)
- Materias:
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- Resumen
El sistema OPG/ RANKL modula el remodelado óseo. Hormonas como los estrógenos y la vitamina D pueden influir en el remodelado óseo a través de receptores osteoblásticos. El alendronato y el raloxifeno son efectivos fármacos antirresortivos en la enfermedad osteoporótica. Reducen el riesgo de fractura, el remodelado óseo y aumentan la densidad mineral ósea. No se sabe si se puede ejercer un efecto directo en los osteoblastos a través del sistema OPG/ RANKL. Los objetivos de este estudio son: 1. Analizar la secreción de OPG y la expresión genética de OPG y RANKL en cultivos primarios de osteoblastos (hOB) de pacientes con osteoporosis y comparar los resultados con personas sin osteoporosis.2. Evaluar la influencia de los estímulos hormonales 17-ß-estradiol (E2) y 1.25¿(OH)2D3 (VD3) sobre la secreción de OPG y la expresión de OPG y RANKL en cultivos de hOB de ambos grupos de estudio. Comparar la influencia de los estímulos sobre el sistema OPG/RANKL de osteoblastos de pacientes osteoporótico y no osteoporóticos. 3. Evaluar la influencia de los fármacos antiresortivos alendronato (ALE) y raloxifeno (RX) sobre la secreción de OPG y sobre la expresión de OPG y RANKL en cultivos de hOB. Comparar la influencia de los estímulos sobre el sistema OPG/RANKL de hueso osteoporótico y no osteoporótico.
Para ello hemos establecido cultivos primarios de hOB de 39 pacientes (9 hombres y 30 mujeres), con edades comprendidas entre 63 y 92 años. De estos, 18 procedían de pacientes con OA (4 hombres y 14 mujeres) y 21 (5 hombres, 16 mujeres) de pacientes con fractura osteoporótica.
Los pacientes OP eran mayores (82± 7 años) que los pacientes OA (74 ± 6 años). En el grupo OA la edad media de hombres y mujeres fue comparable (Hombres, 71 ± 4 años v.s Mujeres, 73 ± 7 años). En cambio en el grupo de pacientes OP la edad media de las mujeres fue mayor que la de los hombres (Hombres, 74 ± 11 años v.s Mujeres, 84 ± 6 años, p = 0.037). Si comparamos las edades entre un mismo grupo de estudio, las mujeres OP son mayores que las OA (OA, 73 ± 7 años v.s OP, 84 ± 6 años, p = 0.037), mientras que los hombres presentan edades comparables (OA, 71 ± 4 años v.s OP, 74 ± 11 años).
La proliferación de los cultivos de hOB procedentes de pacientes OP fue más lenta que la de los del grupo OA, siendo mayor el tiempo necesario para llegar a la confluencia celular (31 ± 2 días v.s. 20.4 ± 1,1 días, p ¿ 0,05, respectivamente).En los grupos de estudio tanto en OA como en OP, el tiempo de confluencia fue similar entre hombres y mujeres. Sin embargo, si comparamos el tiempo de confluencia de mujeres OP y OA resultó más elevado en las primeras (32 ± 15 días v.s 22 ± 2 días, respectivamente, p = 0,001), al igual que ocurrió en hombres (26 ± 2.75 días v.s. 17 ± 1.5 días, respectivamente, p = 0,032). El tiempo de confluencia del primer pase se correlacionó positivamente con la edad (r = 0.32, p = 0.05). Dado que los pacientes OP eran de mayor edad, ajustamos el tiempo de confluencia celular por esta variable y comprobamos que permanecía siendo más prolongado en el grupo OP (OP: 30 días (CI 95% 26.5-33.5); OA: 20.7 días (CI 95% 17.1-24.3, p ¿ 0.001).
Tras el segundo pase, el crecimiento fue similar entre ambos grupos (OA: 5,9 ± 3,5 días v.s. OP: 6,6 ± 2,8 días). Del mismo modo, este segundo tiempo de confluencia resultó ser comparable entre hombres y mujeres dentro de un mismo grupo OA ( Hombres: 7 ± 1 v.s. Mujeres: 6 ± 2 días) OP ( Hombres: 5 ± 0.5 días v.s. Mujeres : 7 ± 1 días ) y equivalentes entre mujeres de distinto grupo ( OA: 6 ± 2 días v.s. OP:7 ± 1 días) y hombres de distinto grupo ( OA: 7 ± 1 días v.s. OP: 5± 0.5 días).
El índice de masa corporal (IMC) fue menor en pacientes OP (28,06 ± 4,9) que en el grupo OA (33,9 ± 0,94) (p¿ 0,05). Sin embargo, no existe correlación entre IMC y el tiempo de confluencia celular.
Valoramos la secreción de OPG, mediante técnica de ELISA, en los medios recogidos de los cultivos estimulados con E2 y 1.25D.
Los niveles basales de secreción de OPG fueron un 90 % más altos en el grupo OP (7,7 ± 1 pmol/L) que los encontrados en el grupo OA (4,1 ± 0,7 pmol/L), diferencia que alcanzó significación estadística (p¿ 0.05). La secreción de OPG entre hombres y mujeres en los dos grupos resultó ser similar (OA; Hombres: 3,6 ± 0,72 v.s. Mujeres: 4,36 ± 0,86 pmol/L), (OP; Hombres: 5,69 ± 1,39 v.s Mujeres; 7,79 ± 1,15 pmol/L). Los niveles de secreción de OPG de cultivos de hOB de mujeres OP ( 7, 79 ± 1,15 pmol/L ) fue un 79% mayor que los de mujeres OA (4,36 ± 0,86 pmol/L, p = 0,025 ) del mismo modo encontramos niveles más altos de secreción de OPG - un aumento del 58% - en cultivos de hOB de hombres OP ( 5,69 ± 1,39 pmol/L) que en cultivos de pacientes OA ( 3,6 ± 0,72 pmol/L, p=0.037 ) El tratamiento con E2 y 1.25D o E2+1.25D no modificó los niveles de secreción de OPG en ninguno de los dos grupos de estudio. Tras la estimulación con E2 y 1.25D o E2+1.25D los niveles se secreción de OPG seguían manteniéndose significativamente superior en cultivos de hOB de pacientes OP respecto a los de OA en todas las condiciones analizadas (p¿ 0.05).
Analizamos la expresión génica de OPG y RANKL mediante RT-PCR semicuantitativa. Los valores obtenidos fueron normalizados con la expresión génica de -actina. Los valores absolutos son expresados como media±ES u.r. y las modificaciones inducidas por los distintos estímulos como cambios porcentuales del valor basal.
La expresión de OPG de los cultivos de hOB fue comparable entre los dos grupos de estudio (OP: 0.95 ± 0.09 u.r; OA: 0.93 ± 0.07 u.r). La estimulación celular con E2, 1.25D o E2+1.25D no provoco ningún cambio aparente.
La expresión de RANKL basal fue similar entre ambos grupos de estudio (OP: 0.30 ± 0.06 u.r; OA: 0.32 ± 0.08 u.r). En el grupo OP, hubo un incremento significativo, por encima del 200% en repuesta a 1,25D (129 %, p = 0.004) y a E2+1,25D (152 %, p = 0.027). Sin embargo, en el grupo OA no hubo respuesta a E2 y mostró un ligero aumento aunque no significativo a 1,25D (78 %) y E2+1,25D (122 %) .
El cociente RANKL/ OPG se calculó dividiendo los valores absolutos de la expresión molecular de cada paciente. Para cada grupo se muestran los valores medios y el error estándar de ARNm de RANKL / OPG, de todos los pacientes. Tomamos los valores medios de la situación basal como el 100 % y las modificaciones debidas a los distintos estímulos la expresamos como un cambio porcentual de la misma.
La ratio de la expresión de RANKL/OPG en cultivos de hOB de pacientes OP fue mayor tanto basalmente (OP: 0.42 ± 0.12 u.r; OA: 0.32 ± 0.06 u.r) como en todas las condiciones experimentales estudiadas. Tras la estimulación con 1,25D y E2+1,25D hubo un incremento algo mayor del 150% en el grupo OP (p = 0,004 y p = 0,008 respectivamente). Al igual que lo que sucedía con la expresión de RANKL, la presencia de E2 en el medio de cultivo no modifico el ratio RANKL/OPG. En el grupo OA, no hubo cambios del cociente RANKL/OPG en ninguna de las condiciones analizadas No hubo relación entre los niveles de secreción de OPG, de ARNm de OPG y RANKL, ni tampoco entre estos genes y la confluencia celular o la edad de los pacientes en ninguno de los grupos estudiados.
En este estudio evaluamos la influencia del alendronato (ALE) y el raloxifeno (RX) en la expresión genética de las citoquinas RANKL, OPG, y la secreción proteica de OPG en cultivos de hOB procedentes tanto de pacientes OA como de pacientes OP y comparamos a su vez el efecto de estos fármacos antireabsortivos entre ambos grupos de estudio.
Estudiamos la secreción de OPG, mediante técnica de ELISA, en los medios recogidos de los cultivos estimulados con ALE y RX.
El tratamiento con ALE y RX no produjo cambios en los niveles de secreción de OPG en ninguno de los grupos estudiados.
Determinamos la expresión de ARNm de OPG y RANKL mediante RT-PCR semicuantitativa. Los valores obtenidos fueron normalizados con la expresión de ARNm de -actina. Los resultados son expresados en tanto por ciento respecto a la condición basal de cada grupo.
Al analizar la expresión de ARNm de OPG, en cada grupo individualmente, observamos que el grupo de cultivos de hOB de pacientes OP presentó aumentos superiores tras los distintos tratamientos, respecto al grupo OA. En el grupo OP, con ALE el aumento fue muy discreto, de sólo el 10%, sin embargo, llegó a ser significativo tras ser tratado con RX ( 35 %, p= 0.038). Entre el grupo OP y OA no encontramos diferencias significativas en las distintas condiciones de estudio.
La expresión de ARNm de RANKL resultó ser mayor tras los tratamientos con ALE y RX en el grupo OP respecto al OA. En los cultivos de pacientes OP tratados con RX el aumento fue del 60 % (p = 0 .013) y en los tratados con ALE del 118% (p = 0.05). Los cambios observados en el grupo OA fueron menores y no llegaron a ser significativos, respecto al valor basal.
No hubo correlación entre los niveles de secreción de OPG, ni de ARNm de OPG, ni de ARNm de RANKL y tampoco entre el tiempo de confluencia celular, ni en la edad de los pacientes en ninguno de los grupos estudiados.
El cociente RANKL/ OPG se calculó dividiendo los valores absolutos de la expresión molecular de cada paciente. Para cada grupo se muestran los valores medios y el error estándar de ARNm de RANKL/OPG, de todos los pacientes. Tomamos los valores medios de la situación basal como el 100 % y las modificaciones debidas a los distintos estímulos la expresamos como un cambio porcentual de la misma.
La ratio de la expresión de ARNm de RANKL/OPG en cultivos de hOB de pacientes OP fue mayor que la de los pacientes OA en todas las condiciones analizadas, llegando a ser significativa tras el tratamiento con RX (p = 0.02). Tras los estímulos con ALE y RX hubo un incremento del 112% y del 60% en el grupo OP (p = 0.048 y p = 0.017). Sin embargo, en los cultivos de hOB de pacientes OA prácticamente no se vio modificada por ninguna de las condiciones.
En resumen, en nuestro estudio demostramos que los hOB en cultivo de pacientes con fractura de cadera confluyen más lentamente que los de pacientes con OA y producen mayor secreción proteica de OPG en todas las condiciones del cultivo que hemos experimentado. La adicción de 1,25D, 1,25D + E2, ALE y RX al cultivo incrementa significativamente la expresión génica de RANKL y la ratio RANKL/OPG, además de OPG, para el caso de RX, en los hOB de pacientes OP, hecho que no se comprueba para los pacientes con OA. Estos resultados demuestran que estas hormonas y fármacos antireabsortivos, ejercen una acción directa sobre el osteoblasto, un efecto más marcado en situaciones de alteración del remodelado óseo, como es la enfermedad osteoporótica y, por último, una capacidad moduladora sobre el sistema de intercomunicación de osteoblasto y osteoclasto OPG/RANKL que, en última instancia, es el responsable de regular la actividad de remodelado óseo.
