Evaluación de los efectos del azul de metileno en el síndrome de isquemia-reperfusión intestinal en conejos
- Autores: Sergio Ventura
- Directores de la Tesis: Juan Morgaz Rodríguez (dir. tes.), Rafael Zafra Leva (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 2022
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Eliseo Belda Mellado (presid.), Mónica Rubio Zaragoza (secret.), Irene Magdalena Rodríguez Gómez (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biociencias y Ciencias Agroalimentarias por la Universidad de Córdoba
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Helvia
- Resumen
EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS DEL AZUL DE METILENO EN EL SÍNDROME DE ISQUEMIA-REPERFUSIÓN INTESTINAL EN CONEJOS 1. introducción o motivación de la tesis La isquemia intestinal puede deberse a causas obstructivas, como patologías trombo-embólicas, o no-obstructivas de bajo flujo como en diferentes tipos de shock. El vaso involucrado con más frecuencia es la arteria mesentérica, pero los vasos venosos también pueden verse afectados empeorando el cuadro. La isquemia intestinal produce una disminución de la entrega de oxígeno al compartimento esplácnico que se traduce en una depleción de adenosina trifosfato y glicolisis anaerobia con alteraciones electrolíticas y enzimáticas hasta la muerte celular. El retorno de la perfusión sanguínea puede resolver el daño, pero según la duración de la fase isquémica, la vuelta del oxígeno puede desencadenar una serie de alteraciones aún más graves a nivel local y sistémico, conocidas como síndrome de isquemia-reperfusión (IR) [1]. Los mecanismos del daño por reperfusión son aún objeto de estudio, entre ellos hay un aumento de permeabilidad vascular, la infiltración e adhesión de granulocitos, la producción de radicales tóxicos de oxígeno y nitrógeno con consecuente peroxidación lipídica, la producción de óxido nítrico y la activación de diferentes vías moleculares y celulares con una respuesta inflamatoria sistémica. Como resultado de esta condición se producen alteraciones hemodinámicas que pueden traducirse en un shock frecuentemente refractario a las terapia vasoconstrictoras tradicionales. Las alteraciones producidas por la IR causan daño tisular directo e indirecto en los órganos afectados y la respuesta sistémica puede llevar a un síndrome de disfunción multiorgánica [2]. La apoptosis es el mecanismo principal de muerte celular asociada a la IR [3] y en su actuación resulta clave la expresión de cisteínas endoproteasas denominadas caspasas. Se han investigado muchos tratamientos contra el daño por IR y entre ellos el azul de metileno (MB) . El mecanismo de acción del MB es complejo y no del todo comprendido aunque se ha visto que puede bloquear la producción de anión superóxido [4], inhibir la guanilato ciclasa y la óxido nítrico sintetasa, reduciendo los niveles de cGMP y bloqueando la acción del óxido nítrico. Por estos efectos el MB ha sido utilizado en diferentes investigaciones con resultados a veces contrastados considerando bien el aspecto hemodinámico [5] o el daño tisular [6]. El objetivo de este trabajo fue evaluar los efectos de diferentes dosis de MB seguidos por una infusión a ritmo constante (CRI) de MB sobre las alteraciones hemodinámicas y el daño tisular local y en órganos distantes causado por el síndrome de IR intestinal utilizando como modelo animal el conejo.
2.contenido de la investigación Metodología En este estudio fueron utilizados 21 conejos New Zealand White (10 machos y 11 hembras). Todos los conejos procedían de un centro de cría de animales de investigación y estaban sanos. El estudio fue aprobado por el comité ético de la Universidad de Córdoba (NRG/6897. Los animales fueron sedados con morfina (0.3 mg/kg IM) y medetomidina ( 15 µg/kg IV). Se indujeron con propofol IV a dosis-efecto, se les puso un tubo endotraqueal y la anestesia se mantuvo con isofluorano administrado en una mezcla de oxígeno y aire al 50%. Se introdujo un catéter en la vena yugular externa derecha y un catéter Pulsiocath en la arteria femoral derecha y se tomaron muestras de sangre para los valores basales. Durante todo el estudio se mantuvo la normocapnia mediante ventilación mecánica, la temperatura a 37°C usando una manta de aire caliente, se administró Ringer lactato IV a 5 mL/kg/h en la vena auricular lateral y se mantuvo la analgesia con morfina cada 4 horas. A través de una celiotomía mediana se ocluyeron la vena porta y la arteria mesentérica cranial con clamps vasculares iniciando el periodo isquémico de 60 minutos. Los animales se dividieron en 3 grupos de forma aleatoria. En el grupo MB5 los animales recibieron un bolo de 5 mg/kg de MB en 10 minutos, seguido por una CRI de MB a 2 mg/kg/h, en el grupo MB20 recibieron un bolo de 20 mg/kg de MB en 10 minutos, seguido por una CRI de MB a 2 mg/kg/h y en el grupo control recibieron, con la misma pauta, los mismos volúmenes, pero de solución fisiológica (SF). Diez minutos antes del final de las fase isquémica se empezó a administrar el tratamiento y se quitaron entonces los clamps vasculares comenzando la fase de reperfusión de 360 minutos. Frecuencia cardiaca (HR), presiones arteriales invasivas (MAP, SAP,DAP), gasto cardiaco (CO), resistencia vascular sistémica (SVR), volumen sistólico (SV), variación de volumen sistólico (SVV) y contractilidad cardiaca (dPmx) fueron medidos utilizando un monitor PiCCO. Cada 15 minutos se registraron, usando un monitor multiparamétrico, los valores de frecuencia respiratoria (RR), CO2 al final de la expiración (EtCO2) y saturación arterial de oxígeno (SpO2). Los valores de hemoglobina (Hb), lactato y las mediciones gasométricas se obtuvieron de muestras arteriales tomadas en periodo basal; al comienzo (I0), a 30 (I30) y 50 (I50) minutos de la fase isquémica; a 60 (R60), 120 (R120), 240 (R240) y 360 (R360) minutos en la fase de reperfusión. La entrega de oxígeno (DO2) y la cantidad arterial de oxígeno (CaO2) fueron calculadas según la literatura. CO, SV y SVR fueron valorados como parámetros indexados (CI, SVI y SVRI). Al final de la experiencia los animales fueron eutanasiados y se tomaron muestras de duodeno, yeyuno, íleon, riñón, hígado y pulmón, que se guardaron en formaldehido al 10%. Las muestras fijadas en formol fueron embebidas en parafina y cortadas a 4 µm de grosor. Para el estudio histopatológico los cortes fueron teñidos con hematoxilina-eosina y la evaluación de los tramos de intestino se hizo acorde con la escala de Park-Chiu [6], con puntuaciones de 0 a 8, donde 0 es un órgano sano y 8 es el máximo nivel de daño histológico. En la evaluación de riñón, hígado y pulmón se utilizaron escalas semi-cuantitativas con puntuaciones de 0 a 3, donde 0 es un órgano sano y 3 se refiere al máximo grado de daño tisular; en el estudio del pulmón se evaluó también el nivel de infiltración de neutrófilos usando una escala semi-cuantitativa a 4 valores referida al número medio de neutrófilos en 10 campos a 100 aumentos. Con cortes de duodeno, yeyuno e íleon se prepararon también muestras para el estudio inmunohistoquímico utilizando el kit SignalStain® Cleaved Caspase-3 (Asp175) IHC Detection Kit (Cell Signalling Technology, Danvers, MA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. El área positiva a caspasa 3 fue calculada usando el software Image J. Se estudiaron un total de 5 campos de 40x por cada tramo de intestino delgado. La normalidad de los parámetros se evaluó usando el test de Shapiro-Wilk. Para el estudio hemodinámico se utilizó un modelo mixto generalizado linear para encontrar diferencias entre tratamientos (control, MB5, MB20) y fases (basal, isquemia, reperfusión) y entonces se aplicó un ANOVA de una vía con un test post-hoc de Bonferroni o de Games-Howell. En el estudio histopatológico se compararon los grupos mediante un análisis no paramétrico de varianza para un criterio de clasificación (Kruskal-Wallis) con una prueba post-hoc de Bonferroni. Los valores de P<0.05 fueron considerados estadísticamente significativos.
Resultados Datos hemodinámicos: No hubo diferencias en ningún parámetro entre los grupos en el periodo basal y en el isquémico. En la fase isquémica hubo una reducción significativa de HR (P = 0,001), MAP (P = 0,001), SAP (P = 0,001), DAP (P = 0,001), CI (P = 0,001), SVI (P = 0,001), dPmx (P = 0,001), CaO2 (P = 0,001), DO2 (P = 0,001) y un aumento significativo de lactato (P = 0,001), SVV (P = 0,001), y SVRI (P = 0,005), en todos los grupos. En la fase de reperfusión hubo un aumento significativo de HR (P = 0,001), MAP (P = 0,001), DAP (P = 0,001), SAP (P = 0,001), CI (P = 0,001), dPmx (P = 0,001), SVI (P = 0,001) y DO2 (P = 0,001) y una dismiución de SVV (P = 0,001) y lactato (P = 0,001) en MB5 comparado con el grupo control. Se obtuvieron resultados parecidos por HR (P = 0,001), MAP (P = 0,001), SAP (P = 0,001), CI (P = 0,001), dPmx (P = 0,001), SVI (P = 0,001) y DO2 (P = 0,001) entre MB20 y el control. La elevación de HR y presiones arteriales y la disminución de lactato y SVV fue significativamente mayor en MB5 comparado con MB20 y el control. Datos anatomopatológicos: En la evaluación histopatológica hubo diferencias significativas entre MB5 y el control en duodeno (P = 0,002), yeyuno (P = 0,0001) e íleon (P = 0,003), mientras que no hubo diferencias entre MB20 y el control menos que en duodeno (P = 0,040). En la evaluación histopatológica de los tramos intestinales se observó una reducción significativa en las lesiones observadas en el grupo MB5 respecto a MB20. No hubo diferencias estadísticas entre los tres grupos en la evaluación histopatológica de hígado, riñón y pulmón. En la evaluación de las áreas positivas a caspasa 3 hubo diferencias significativas entre MB5 y el control en duodeno (P = 0,010), yeyuno (P = 0,020) e íleon (P = 0,010). No hubo en cambio diferencias en los resultados inmunohistoquímicos entre MB20 y el control y en los tres tramos intestinales considerados hubo una mejoría significativa en MB5 con respecto a MB20.
3.conclusión El tratamiento con azul de metileno fue capaz de contrarrestar la depresión cardiovascular asociada al síndrome de I/R intestinal, con una mejora en el gasto cardiaco, la precarga, la contractibilidad, la perfusión y la oxigenación de los tejidos. El tratamiento empleado en el grupo MB5 (5 mg/kg IV + 2 mg/kg/h) fue el más efectivo. El mismo tratamiento fue efectivo en disminuir de manera significativa el daño tisular intestinal y el nivel de apoptosis celular. El tratamiento no fue eficaz a la hora de proteger del daño en órganos distantes como hígado, riñón y pulmón. La efectividad del azul de metileno no ha seguido un patrón dosis-dependiente, habiendo obtenido resultados peores en el grupo MB20.
4. bibliografía [1] PA. Grace, Ischaemia-reperfusion injury. Br J Surg. 1994, 81, p. 637-647. [2] P Vjadovich, Free radicals and antioxidants in inflammatory processes and ischemia-reperfusion injury. Vet Clin. Small Anim. 2008, 38, p. 31-123. [3] KA Kuenzler, PY Pearson, MZ Schwartz, IL-11 pretreatment reduces cell death after intestinal ischemia-reperfusion. J Surg Res. 2002, 108, p. 268-272.
[4] SC Salaris, CF Babbs, WD Voorhees III, Methylene blue as an inhibitor of superoxide generation by xanthine oxidase: a potential new drug for the attenuation of ischemia/reperfusion injury. Biochemical Pharmacology. 1991, 42(3), p. 499-506. [5] CA Paciullo, D McMahon Horner, KW Hatton, JD Flynn, Methylene blue for the treatment of septic shock. Ann Pharmacol. 2010, 30, p. 702-715. [6] FH Greca, NM Goncalves, ZA Souza Filho, L Naronha, RF Silva, MR Rubin, The protective effect of methylene blue in lungs, small bowel and kidney after intestinal ischemia and reperfusion. Acta Cir Bras. 2008, 23(2), p. 149-156.
