Nitric oxide oxidative production from tryptophan derivatives of the indole-3-acetic acid biosynthesis pathway in plants

• Autores: Pedro López Gómez
• Directores de la Tesis: José Fernando Morán Juez (dir. tes.), Alejandro Chamizo Ampudia (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Pública de Navarra ( España ) en 2022
• Idioma: inglés
• Número de páginas: 346
• Títulos paralelos:
  • Producción oxidativa de óxido nítrico a partir de derivados de triptófano de la ruta de biosíntesis del ácido indol-3-acético en plantas
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Academica-e
• Resumen
  • español

    El óxido nítrico (NO) es una pequeña molécula que posee una amplia gama de funciones fisiológicas en los organismos vivos. En las plantas, se ha revelado que el NO está involucrado en muchas funciones fisiológicas, como la germinación, la floración, la senescencia de las hojas y en la respuesta al estrés ambiental. En plantas, la producción de NO ha sido bien caracterizada en rutas reductoras, como la ruta de la nitrato reductasa. Dado que las plantas cultivadas axénicamente con NH4+ como única fuente de N han exhibido contenidos de NO2− y NO3−, esto evidencia la existencia de una vía metabólica para la producción oxidativa de NO. La presencia de óxido nítrico sintasas (NOS) en bacterias, hongos y animales ha dado lugar a una intensa búsqueda de una enzima similar a la NOS en las plantas. Las oximas (R1R2C=NOH) son compuestos importantes que conectan los metabolismos general y especializado que se ha informado que liberan NO en entornos básicos. En particular, la planta oxima indol-3-acetaldoxima (IAOx) está relacionada con la síntesis de glucosinolatos en Brassicaceae y es un intermediario de la biosíntesis dependiente de Trp del ácido in-dol-3-acético (IAA), compartiendo ambos oxima y estructura indólica IAA. Además, se ha descrito bien que el IAA encaja e interactúa en el centro activo de la peroxidasa de rábano picante (POD). De hecho, la reacción de POD con IAA se ha sugerido como una terapia oncológica para producir especies tóxicas. A lo largo del primer capítulo de este trabajo, se probaron varias enzimas y oximas, incluida la IAOx, para determinar la producción de NO. optimizando los requisitos técnicos y las condiciones de reacción para su detección y medición. Como resultado, se demostró la producción de NO in vitro tras la oxidación de IAOx catalizada por POD, así como el importante papel del radical superóxido (O2−) en esta reacción. Además, se demostró que el O2− y las flavinas aumentaron significativamente la producción de NO, mientras que el oxígeno (O2) y el agotamiento de O2− la redujeron. Además, se evaluó que el IAOx actuaba como sustrato de la enzima de ratón iNOS, produciendo cantidades significativas de NO. Finalmente, considerando los resultados obtenidos, se sugirió una nueva hipótesis para la producción oxidativa de NO en plantas, denominada Mecanismo para la Construcción de un Análogo de la Sintasa de Óxido Nítrico (MECANOS). En el segundo capítulo, los efectos de la exposición a IAOx en plantas de tipo salvaje (WT) de Arabidopsis thaliana, así como su acumulación en mutantes sur1.1 se analizaron en plantas que crecieron en NH4+ como única fuente de N. Posteriormente, estas plantas mostraron el típico fenotipo de superraíz, que comparte características con las plantas expuestas al NO y ha sido descrito como consecuencia de la acumulación de AIA; aunque se ha demostrado que el fenotipo IAOx difiere del que se presenta tras la exposición IAA. Además, se informaron niveles más altos de NO en raíces de A. thaliana expuestas a IAOx que en el control o en plantas expuestas a IAA, mediante la sonda de detección DAF-2 DA. Aún más, ambas plantas WT expuestas a mutantes IAOx y sur1.1 mostraron mayores niveles de IAA interno que el control no tratado. Finalmente, el análisis de la expresión genética de varias peroxidasas de A. thaliana mostró que ambas plantas WT expuestas externamente a IAOx y sur1. 1 mutantes regularon a la baja estas enzimas extracelulares o intracelulares, respectivamente, lo que demuestra que la producción de NO por IAOx estaba estrechamente regulada transcripcionalmente. En conjunto, se demostró que los efectos in vivo de IAOx en A. thaliana son consecuencia de una acumulación de IAA y un aumento de NO. En el tercer capítulo, se abordó el análisis de los efectos de IAOx sobre los contenidos moleculares de cultivos celulares de A. thaliana. Con éxito, un total de 26 moléculas fueron detectadas por GC-MS y catalogadas. Posteriormente, un proceso de marcaje previo a un Análisis de Componentes Principales (PCA) confirmó que la reducción en los contenidos de Trp observada en las células estaba relacionada con los tratamientos con IAOx y S-nitrosoglutatión donante de NO (GSNO) y, por tanto, con el NO. Aún más, las diferencias entre los contenidos moleculares de las células tratadas con IAOx y GSNO se explicaron principalmente por las del ácido bencenopropanoico, un miembro de la familia de los fenilpropanoides altamente asociado con los niveles de IAA. En consecuencia, la adición de IAOx de hecho produjo NO dentro de las células de A. thaliana, y IAOx puede servir como fuente de IAA o alterar la homeostasis. Con todo, a lo largo de las páginas de este trabajo, se proporcionan varias pruebas in vitro e in vivo para afirmar que la oxidación de IAOx produce NO, junto con varias pruebas de los efectos del NO en la organogénesis de la raíz, la expresión génica y contenidos moleculares en plantas de A. thaliana. e IAOx pueden servir como fuente de IAA o alterar la homeostasis. Con todo, a lo largo de las páginas de este trabajo, se proporcionan varias pruebas in vitro e in vivo para afirmar que la oxidación de IAOx produce NO, junto con varias pruebas de los efectos del NO en la organogénesis de la raíz, la expresión génica y contenidos moleculares en plantas de A. thaliana. e IAOx pueden servir como fuente de IAA o alterar la homeostasis. Con todo, a lo largo de las páginas de este trabajo, se proporcionan varias pruebas in vitro e in vivo para afirmar que la oxidación de IAOx produce NO, junto con varias pruebas de los efectos del NO en la organogénesis de la raíz, la expresión génica y contenidos moleculares en plantas de A. thaliana.

  • English

    Nitric oxide (NO) is a small molecule that possesses a wide range of physiological functions in living organisms. In plants, NO has been revealed to be involved in many physiological functions, such as germination, flowering, leaf senescence, and in the response to environmental stresses. In plants, NO production has been well characterised in reductive routes, as the nitrate reductase pathway. Since plants grown axenically with NH4+ as the sole source of N have exhibited contents of NO2− and NO3−, this evidences the existence of a metabolic pathway for the oxidative production of NO. The presence of nitric oxide synthases (NOS) in bacteria, fungi, and animals has given rise for an intense search for a NOS-like enzyme in plants. Oximes (R1R2C=NOH) are important compounds connecting the general and specialised metabolisms that have been reported to release NO in basic environments. In particular, the plant oxime indole-3-acetaldoxime (IAOx) is related to the synthesis of glu-cosinolates in Brassicaceae and is an intermediate of the Trp-dependent biosynthesis of in-dole-3-acetic acid (IAA), sharing both oxime and IAA indolic structure. Furthermore, it has been well described that the IAA fits and interacts at the active centre of the horseradish peroxidase (POD). Indeed, the reaction of POD with IAA has been suggested as an onco¬logical therapy to produce toxic species. Throughout the first chapter of this work, several enzymes and oximes including IAOx were tested for NO production, by optimising the technical requirements and reac-tion conditions for its detection and measurement. As a result, it was demonstrated the NO production in vitro after IAOx oxidation catalysed by POD, as well as the important role of the superoxide radical (O2−) in this reaction. Moreover, it was shown that O2− and flavins significantly increased the production of NO, while oxygen (O2) and O2− depletion reduced it. Besides, it was assessed that the IAOx acted as a substrate for the mouse enzyme iNOS, producing significant amounts of NO. Finally, considering the results obtained, a new hy-pothesis for the NO oxidative production in plants was suggested, named as Mechanism for the Construction of an Analog of Nitric Oxide Synthase (MECANOS). In the second chapter, the effects of IAOx exposition in Arabidopsis thaliana wild-type (WT) plants, as well as its accumulation in sur1.1 mutants were analysed in plants growing in NH4+ as the sole N source. Afterwards, these plants showed the typical super-root phenotype, that shares characteristics with that of NO-exposed plants and has been described as a consequence of IAA accumulation; although it has been demonstrated that the IAOx phenotype differs from that after IAA exposition. Furthermore, there were report¬ed higher levels of NO in A. thaliana roots exposed to IAOx than in the control or in IAA exposed plants, by the DAF-2 DA sensing probe. Even more, both WT plants exposed to IAOx and sur1.1 mutants showed increased levels of internal IAA than the untreated con¬trol. Finally, the analysis of the genetic expression of several A. thaliana peroxidases showed that both WT plants externally exposed to IAOx and sur1.1 mutants downregulated these extracellular or intracellular enzymes, respectively, proving that NO production by IAOx was tightly transcriptionally regulated. Altogether, the in vivo effects of IAOx in A. thaliana were demonstrated to be consequence of an accumulation of IAA and an increase in NO. In the third chapter, it was addressed the analysis of IAOx effects on the molecular contents of A. thaliana cell cultures. Successfully, a total of 26 molecules was detected by GC-MS and catalogued. Subsequently, a labelling process prior to a Principal Component Analysis (PCA) confirmed that the reduction in Trp contents observed in cells was related to IAOx and NO donor S-nitrosoglutathione (GSNO) treatments and, therefore, with NO. Even more, the differences between the molecular contents of cells treated with IAOx and GSNO were mainly explained by those in benzenepropanoic acid, a member of the phenyl¬propanoids family highly associated with IAA levels. Consequently, IAOx addition indeed produced NO within A. thaliana cells, and IAOx either can serve as IAA source or disrupt the homeostasis. All in all, throughout the pages of this work, there are provided several in vitro and in vivo pieces of evidence to affirm that the oxidation of IAOx produces NO, together with sev-eral proofs of NO effects on root organogenesis, gene expression, and molecular contents in A. thaliana plants.