Resumen de Identificación de las familias de factores de transcripción wrky y proteínas vq en fresa y caracterización del papel de fawrky1 en la respuesta de defensa del fruto frente a colletotrichum acutatum
1. Introducción o motivación de la tesis La fresa cultivada (Fragaria x ananassa) es la fruta blanda de mayor importancia económica, apreciada tanto por sus propiedades organolépticas como nutricionales. España es el sexto país productor a nivel mundial y el principal exportador, dedicando una superficie para su cultivo de unas 372.361 ha (FAOSTAT, 2018).
Se estima que entre el 25-30% de la producción de fresa se pierde como consecuencia de enfermedades producidas por diversos patógenos, que afectan notablemente al desarrollo de la planta y la calidad del fruto. La antracnosis, causada por diferentes especies del hongo Colletotrichum, es una de las enfermedades que más alarma. C. acutatum está considerado un organismo de cuarentena en Europa (Directiva EC 77/93, Real Decreto 2071/1993).
Los factores de transcripción WRKY constituyen una gran familia de proteínas implicadas en la regulación varios procesos biológicos en plantas y de las respuestas frente a estreses de origen biótico y abiótico. Tenemos evidencias moleculares que apuntan a la importancia de los WRKY como reguladores de diferentes procesos biológicos en la fresa y, concretamente, de la respuesta de defensa frente a C. acutatum. Por tanto, se caracterizará la familia WRKY de fresa y se estudiará la expresión de en distintos tejidos para obtener un atisbo de sus funciones biológicas. Además, el gen FaWRKY1 (ortólogo de AtWRKY75) ha sido identificado previamente como un posible regulador positivo de la resistencia frente a patógenos, siendo expresado en fresa en respuesta a la infección por C. acutatum. Por ello, en este trabajo también se pretende caracterizar detalladamente su papel en la respuesta de defensa de la fresa.
Las proteínas con motivo valina-glutamina (proteínas VQ) son un tipo de proteínas reguladoras relativamente nuevo, capaces de establecer interacciones proteína-proteína con los factores de transcripción WRKY pertenecientes a los grupos I y IIc y modular su actividad, positiva o negativamente. Puesto que la familia VQ de fresa no ha sido descrita y sus funciones son desconocidas, también nos proponemos abordar su identificación y caracterización funcional.
2. Contenido de la investigación 2.1. Estudio comprensivo de la familia de factores de transcripción WRKY en fresa (Fragaria vesca y Fragaria x ananassa). (Pendiente de envío y publicación) El presente estudio representa una actualización completa de la familia WRKY de fresa mediante el uso de los ensamblajes del genoma más completos y precisos y anotaciones de genes disponibles en la fresa. El uso de las versiones más actuales y completas de los genomas diploide y octoploide nos ha permitido realizar análisis y caracterización muy precisos de la composición de la familia de genes WRKY, su historia evolutiva y patrón de expresión génica en fresa, particularmente en el híbrido octoploide cultivado Fragaria x ananassa.
Así, hemos descrito por primera vez los homeólogos de WRKY y las duplicaciones génicas encontradas en el octoploide. Hemos encontrado un total de 64 genes FvWRKY presentes en el genoma de Fragaria vesca y 257 ortólogos FaWRKY correspondientes en el genoma del alo-octoploide cultivado Fragaria x ananassa (cv. Camarosa). Nuestros resultados muestran que la familia WRKY de fresa muestra un alto grado de conservación tanto entre especies silvestres como cultivadas. El análisis de sintenia mostró que los miembros FaWRKY son en gran parte sinténicos y colineales con sus ortólogos FvWRKY, a pesar de puntuales pérdidas génicas y erosión de la sintenia detectadas en el octoploide, probablemente como resultado de cambios genómicos introducidos por los eventos de hibridación y a la adopción de la poliploidía. La familia WRKY de fresa se ha expandido por antiguos eventos de duplicación del genoma (WGD), originando varias duplicaciones segmentales y en tándem que resultan en varios genes parálogos. Por otra parte, la mayoría de los parálogos detectados en Fragaria x ananassa no existen en Fragaria vesca, por lo que podrían deben haberse originado en las especies poliploides parentales F. virginiana y F. chiloensis, en las cuales los mecanismos inherentes a la poliploidización parecen haber producido roturas de la sintenia entre parálogos ancestrales así como nuevas duplicaciones génicas, ausentes en el genoma diploide. O incluso, podrían haberse originado más recientemente, particularmente aquellos genes parálogos que muestran valores de Ks extremadamente bajos.
La expresión génica está relacionada con la funcionalidad, y su análisis puede arrojar luz sobre las funciones biológicas de los genes estudiados. Por lo tanto, los patrones de expresión de la mayoría de los genes WRKY difieren en los tejidos de fresa aquí considerados (hojas, raíz, frutos en distintos estadios de maduración e infección con hongos patógenos), evidenciando diferencias en su relevancia funcional a través de diferentes tejidos y condiciones de crecimiento. Es importante destacar que muchos WRKYs de fresa cambiaron notablemente su nivel de expresión, o se expresaron diferencialmente, en las respuestas de defensa y durante las etapas de maduración del fruto, lo que indica su importancia en estos procesos biológicos clave. Además, las diferencias en el patrón de expresión detectadas entre varios FaWRKY parálogos y homeólogos señalan la existencia tanto de una expresión génica finamente regulada para lograr posibles efectos genéticos aditivos, como divergencias funcionales evolutivas.
Estos datos pueden ayudar a estudios futuros a profundizar nuestra comprensión del papel regulador de la familia WRKY de fresa, así como ser considerados en programas de mejora genética de fresa avanzados.
2.2. Las proteínas VQ de la fresa diploide y poliploide.
Publicación asociada: Garrido-Gala J, Higuera JJ, Muñoz-Blanco J, Amil-Ruiz F, Caballero JL. The VQ motif-containing proteins in the diploid and octoploid strawberry. Sci Rep. 2019 Mar 20;9(1):4942. doi: 10.1038/s41598-019-41210-4.
Las proteínas que contienen motivos VQ de plantas son una clase recientemente descubierta de proteínas reguladoras de plantas que interactúan con factores de transcripción WRKY capaces de modular su actividad como reguladores transcripcionales. El motivo VQ (FxxhVQxhTG) es el elemento principal en la interacción WRKY-VQ, mientras que un motivo variable recientemente identificado parece ser determinante para la especificidad. La familia VQ se ha estudiado en varias especies y parece desempeñar un papel importante en una variedad de procesos biológicos, incluida la respuesta a las tensiones bióticas y abióticas. Aquí, presentamos un estudio sistemático de la familia VQ tanto en especies de fresa diploide (Fragaria vesca) como octoploide (Fragaria x ananassa). Así, veinticinco genes codificantes para proteínas VQ fueron identificados y veintitrés fueron confirmados más a fondo por análisis de la expresión génica en diversos tejidos y etapas de maduración del fruto. Sus perfiles de expresión también se estudiaron en frutos de F. x ananassa afectados por antracnosis, causada por el hongo ascomiceto Colletotrichum, un patógeno importante de la fresa, y en respuesta a las fitohormonas ácido salicílico y metil-jasmonato, que están bien establecidos como señales centrales de estrés para regular las respuestas de defensa a los patógenos. Este análisis comprensivo arroja luz para una mejor comprensión de las implicaciones de los miembros de la familia de VQ en los mecanismos de defensa contra este importante patógeno de fresa.
Curiosamente, Fv/FaVQ13 exhibe dos dominios propios de la clase NBS-LRR de proteínas R: un dominio NB-ARC (PF00931) y un motivo rico en Leu (LRR_8; PF13855). Esta asociación inusual de tales dominios con el motivo VQ es novedosa, pero una arquitectura similar también fue encontrada en varias proteínas de Oryza sativa, Beta vulgaris, Chenopodium quinoa, Malus domestica y Capsella grandiflora, que albergan dominios similares. Estos dominios típicos de proteínas R también se encuentran asociados a factores WRKY, formando la clase de proteínas de R-WRKY. Por analogía, se ha propuesto el nombre de proteínas R-VQ para esta nueva clase de proteínas VQ. Además, una variedad de dominios asociados con el VQ también se encontró en proteínas de diferentes taxones. Estos hallazgos revelan una complejidad estructural inesperada en la familia de proteínas VQ y sugieren que sus funciones biológicas pueden ser más diversas de lo que actualmente sabemos.
En nuestro estudio filogenético, hemos tenido en cuenta la secuencia del motivo VQ, incluyendo la secuencia secundaria de ocho aminoácidos recientemente identificados que anteceden al motivo VQ principal y realizando una alineación de secuencias basada en la estructura de los dominios VQ de F. vesca, en comparación con Arabidopsis, soja y vid mediante PROMALS3D. Los resultados muestran una distribución de las proteínas VQ en siete grupos, con una disposición específica de grupo para las secuencias de los motivos secundarios. Las secuencias revelan una estructura conservada en las cuatro especies tipo lámina β -bucle- α-hélice para el dominio VQ descrita por Zhou et al. (2016), quienes también sugirieron un papel crítico para el motivo secundario en la interacción WRKY-VQ mediante la modulación de la especificidad de unión del motivo central.
Se encontraron ortólogos de fresa a los principales VQ relacionados con la defensa de Arabidopsis (MKS1, SIB1, SIB2, JAV1 y VQ12, entre otros), lo que indica que pueden existir mecanismos reguladores análogos de defensa en estas dos especies. Los perfiles de expresión de los genes FvVQ mostraron patrones dependientes de distintos tejidos de fresa y grados de maduración del fruto. Además, la mayor parte de ellos fueron regulados en respuesta a la antracnosis, así como al tratamiento hormonal del SA y de MeJA, sugiriendo un papel en las respuestas de la defensa de la fresa. Estos resultados, llevan a considerar a los FaVQs como genes diana valiosos para futuros estudios funcionales y programas de mejora genética.
2.3. El factor de transcripción de fresa FAWRKY1 regula negativamente la resistencia a Colletotrichum acutatum en el fruto tras la infección.
Publicación asociada: Higuera JJ*, Garrido-Gala J*, Lekhbou A, Arjona-Girona I, Amil-Ruiz F, Mercado JA, Pliego-Alfaro F, Muñoz-Blanco J, López-Herrera CJ and Caballero JL (2019). The Strawberry FaWRKY1 Transcription Factor Negatively Regulates Resistance to Colletotrichum acutatum in Fruit upon Infection. Front. Plant Sci. 10:480. doi: 10.3389/fpls.2019.00480 (*Ambos autores contribuyeron por igual a la realización de este trabajo) La fresa (Fragaria x ananassa) es un cultivo alimentario importante a nivel mundial, debido al sabor, aroma y beneficios para la salud de la fruta, pero su productividad y calidad están seriamente limitadas por una gran variedad de fitopatógenos, incluido Colletotrichum spp. Hasta ahora, los factores clave que regulan la respuesta inmune de la fresa siguen siendo desconocidos. El gen FaWRKY1 se ha propuesto previamente como un elemento importante que participa en las respuestas de defensa en la fresa frente a Colletotrichum acutatum. Para obtener más información sobre el papel funcional que desempeña FaWRKY1 en el mecanismo de defensa, se utilizó la transformación transitoria mediada por Agrobacterium tanto para silenciar como para sobreexpresar el gen FaWRKY1 en frutos de fresa (Fragaria x ananassa cv. Primoris), que más tarde se inocularon con Colletotrichum acutatum. Previamente validó la técnica, comprobándose que: 1) la expresión transitoria del transgén permanecía localizada en la mitad agroinfiltrada correspondiente; 2) los niveles detectables de FaWRKY1 cambiaban de acuerdo con la construcción empleada, disminuyendo (RNAi) o aumentando (sobreexpresión); y 3) que la técnica de agroinfiltración no interfería con la expresión del FaWRKY1 endógeno, mediada por el patógeno.
Las pruebas de susceptibilidad se realizaron comparando la severidad de los síntomas causados entre las dos mitades opuestas agroinfiltradas del mismo fruto: una mitad con la construcción para la sobreexpresión de FaWRKY1, o el silenciamiento mediado por RNAi; y la otra mitad con el vector vacío, como control. La severidad de los daños tisulares fue evaluada, encontrándose claramente reducida a los cinco días después de la inoculación del patógeno en la mitad del fruto donde FaWRKY1 fue silenciado transitoriamente, en comparación con la mitad opuesta del control. El análisis estadístico corroboró una reducción significativa en susceptibilidad de la enfermedad cuando la expresión de FaWRKY1 fue silenciada, pero no cuando se comparó la sobreexpresión de FaWRKY1 y las muestras de fruto control, entre las que se encontraron niveles similares de susceptibilidad.
Estos resultados demuestran un papel regulador negativo de FaWRKY1 en la resistencia al hongo fitopatógeno Colletotrichum acutatum en frutos de fresa y contrastan con el papel anteriormente descrito para este gen en Arabidopsis como regulador positivo de resistencia frente a la bacteria Pseudomonas syringae, aunque en otras especies (como vid, melocotón y algodón) también se ha descrito un papel dual de los homólogos a WRKY75, como reguladores positivos o negativos, dependiendo de si la infección es causada por bacterias y hongos biotrofos o si por el contrario, es causada por organismos necrotrofos. Por tanto, basándonos parcialmente en nuestros resultados, así como en resultados anteriores, se propone un modelo para explicar el papel regulador de los genes WRKY75-like durante la infección por patógenos, proponiéndose que actúan como mediadores del balance entre las rutas de defensa dependientes de SA y JA. Nuestros resultados destacan que FaWRKY1 podría mostrar una función diferente según la especie, el tejido vegetal y / o el tipo de patógeno y subrayan el intrincado mecanismo regulador de FaWRKY1 que tiene lugar en los mecanismos de defensa de la fresa contra este importante patógeno.
3. Conclusiones 1. Se han identificado 64 y 257 genes que codifican factores de transcripción WRKY en los genomas de Fragaria vesca y Fragaria x ananassa, respectivamente, incluyendo por primera vez varios genes parálogos y, en el caso del octoploide, también sus genes homoeólogos. Además de conservar una elevada homología en sus secuencias, ambos grupos de genes son, en su mayoría, sinténicos y colineares. Además, están sometidos fundamentalmente a una presión de selección negativa (purificante) que favorece la conservación de sus funciones. La formación de los híbridos octoploides ha originado nuevas duplicaciones génicas que formaron los parálogos en Fragaria x ananassa no presentes en la especie diploide.
2. Los diferentes patrones de expresión y la expresión diferencial de los genes WRKY en varios tejidos indican que cumplen diferentes funciones en la regulación de la fisiología y el desarrollo de la planta de fresa y, concretamente, en la maduración del fruto y en los mecanismos de defensa frente al hongo hemibiotrofo Colletotrichum. La expresión de los parálogos y homoeologos sugiere que actúan de forma aditiva en algunos casos, mientras que en otros, las diferencias en su expresión apuntan a fenómenos de neo- o subfuncionalización.
3. Existen 25 y 96 genes que codifican proteínas VQ en los genomas de Fragaria vesca y Fragaria x ananassa, respectivamente, incluyendo varios genes parálogos y, en el caso del octoploide, también homoeólogos. Además de conservar una elevada homología en sus secuencias, ambos grupos de genes son, en su mayoría, sinténicos y colineares. Además, están sometidos fundamentalmente a una presión de selección negativa (purificante) que favorece la conservación de sus funciones.
4. Se ha encontrado una nueva clase de proteínas VQ, a las que hemos denominado proteínas R-VQ (R protein-VQ). Las proteínas codificadas por los genes FvVQ13, FaVQ13C y FaVQ13D portan dominios NB-ARC y LRR_8 característicos de proteínas R, asociadas comúnmente con la inmunidad innata y proteínas de resistencia a enfermedades en plantas. Aunque la existencia de este nuevo tipo de proteínas VQ ha podido ser verificada en otras especies, no es común en el reino vegetal. Ello sugiere unos mecanismos de aparición similares a los que originaron al grupo de las R protein-WRKY.
5. Los diferentes patrones de expresión y la expresión diferencial de los genes VQ en varios tejidos, así como en respuesta a las fitohormonas SA y MeJA y al hongo hemibiotrofo Colletotrichum acutatum, indican que cumplen diferentes funciones en la regulación de la fisiología y el desarrollo de la planta de fresa y, concretamente, en la maduración del fruto y los mecanismos de defensa.
6. El gen FaWRKY1 es un regulador negativo de la resistencia del fruto de fresa frente a Colletotrichum acutatum. Sin embargo, podría actuar como regulador positivo frente a otros hongos y patógenos bacterianos, como en otras especies. Este papel dual en los mecanismos de resistencia frente a distintos patógenos podría ser ejercido interviniendo sobre el equilibrio de las dos principales rutas de defensa en plantas: las mediadas por ácido salicílico (SA) y ácido jasmónico (JA). De esta forma, se ha propuesto un modelo para la interacción Colletotrichum-fruto en el que FaWRKY1 actuaría potenciando a la ruta de defensa mediada por SA. La regulación negativa sobre la ruta de JA, ejercida por otros genes (JAZ, cuya expresión sería regulada por FaWRKY1), así como el antagonismo entre las dos principales rutas de defensa, provocaría la inhibición de la ruta de JA y un incremento de la susceptibilidad frente a hongos necrotrofos.
4. Bibliografía Shulaev, V., Sargent, D. J., Crowhurst, R. N., Mockler, T. C., Folkerts, O., Delcher, A. L., Jaiswal, P., Mockaitis, K., Liston, A., Mane, S. P., Burns, P., Davis, T. M., Slovin, J. P., Bassil, N., Hellens, R. P., Evans, C., Harkins, T., Kodira, C., Desany, B., … Folta, K. M. (2011). The genome of woodland strawberry (Fragaria vesca). Nature Genetics, 43(2), 109-116. https://doi.org/10.1038/ng.740 Edger, P.P., Poorten, T.J., VanBuren, R. et al. Origin and evolution of the octoploid strawberry genome. Nat Genet 51, 541–547 (2019). https://doi.org/10.1038/s41588-019-0356-4 Bakshi, M., and Oelmuller, R. (2014). WRKY transcription factors: Jack of many trades in plants. Plant Signal Behav 9, e27700.doi: 10.4161/psb.27700 Rinerson, C.I., Rabara, R.C., Tripathi, P., Shen, Q.J., and Rushton, P.J. (2016). Structure and Evolution of WRKY Transcription Factors. 163-181.doi: 10.1016/b978-0-12-800854-6.00011-7 Zhou, Y., Yang, Y., Zhou, X., Chi, Y., Fan, B., and Chen, Z. (2016). Structural and Functional Characterization of the VQ Protein Family and VQ Protein Variants from Soybean. Sci Rep 6, 34663.doi: 10.1038/srep34663 Weyhe, M., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Scheel, D., and Lee, J. (2014). Menage a trois: the complex relationships between mitogen-activated protein kinases, WRKY transcription factors, and VQ-motif-containing proteins. Plant Signal Behav 9, e29519.doi: 10.4161/psb.29519 Jing, Y., and Lin, R. (2015). The VQ Motif-Containing Protein Family of Plant-Specific Transcriptional Regulators. Plant Physiol 169, 371-378.doi: 10.1104/pp.15.00788 Casado-Díaz, A., Encinas-Villarejo, S., Santos, B. de los, Schilirò, E., Yubero-Serrano, E.-M., Amil-Ruíz, F., Pocovi, M. I., Pliego-Alfaro, F., Dorado, G., Rey, M., Romero, F., Muñoz-Blanco, J., & Caballero, J.-L. (2006). Analysis of strawberry genes differentially expressed in response to Colletotrichum infection. Physiologia Plantarum, 128(4), 633-650. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.2006.00798.x Encinas-Villarejo, S., Maldonado, A. M., Amil-Ruiz, F., de los Santos, B., Romero, F., Pliego-Alfaro, F., Muñoz-Blanco, J., & Caballero, J. L. (2009). Evidence for a positive regulatory role of strawberry (Fragaria×ananassa) FaWRKY1 and Arabidopsis AtWRKY75 proteins in resistance. Journal of Experimental Botany, 60(11), 3043-3065. https://doi.org/10.1093/jxb/erp152 Amil-Ruiz, Francisco (2013). Molecular mechanisms of Strawberry Plant Defence against colletotrichum acutatum. PhD thesis, Universidad de Córdoba.Amil-Ruiz, F., Blanco-Portales, R., Muñoz-Blanco, J., & Caballero, J. L. (2011). The strawberry plant defense mechanism: A molecular review. Plant and Cell Physiology, 52(11), 1873-1903. https://doi.org/10.1093/pcp/pcr136 Amil-Ruiz, F., Garrido-Gala, J., Blanco-Portales, R., Folta, K. M., Muñoz-Blanco, J., & Caballero, J. L. (2013). Identification and validation of reference genes for transcript normalization in strawberry (Fragaria × ananassa) defense responses. PLoS ONE, 8(8), e70603. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070603 Amil-Ruiz, F., Garrido-Gala, J., Gadea, J., Blanco-Portales, R., Muñoz-Mérida, A., Trelles, O., de los Santos, B., Arroyo, F. T., Aguado-Puig, A., Romero, F., Mercado, J.-Á., Pliego-Alfaro, F., Muñoz-Blanco, J., & Caballero, J. L. (2016). Partial activation of SA- and JA-defensive pathways in strawberry upon colletotrichum acutatum interaction. Frontiers in Plant Science, 7. https://doi.org/10.3389/fpls.2016.01036 Garrido-Gala, J., Higuera, J. J., Muñoz-Blanco, J., Amil-Ruiz, F., & Caballero, J. L. (2019). The VQ motif-containing proteins in the diploid and octoploid strawberry. Scientific Reports, 9(1), 4942. https://doi.org/10.1038/s41598-019-41210-4 Higuera, J. J., Garrido-Gala, J., Lekhbou, A., Arjona-Girona, I., Amil-Ruiz, F., Mercado, J. A., Pliego-Alfaro, F., Muñoz-Blanco, J., López-Herrera, C. J., & Caballero, J. L. (2019). The strawberry fawrky1 transcription factor negatively regulates resistance to colletotrichum acutatum in fruit upon infection. Frontiers in Plant Science, 10, 480. https://doi.org/10.3389/fpls.2019.00480
