Nuevas estrategias en la monitorización terapéutica de fármacos inmunosupresores: técnicas de "microsampling" de sangre seca y muestras de fluido oral
- Autores: Lucía Paniagua González
- Directores de la Tesis: Angelines Cruz Landeira (dir. tes.), Esteban Otero Antón (codir. tes.), Ana de Castro Ríos (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidade de Santiago de Compostela ( España ) en 2022
- Idioma: español
- Títulos paralelos:
- New strategies for the therapeutic monitoring of immunosuppressive drugs: dried blood microsampling techniques and oral fluid samples
- Tribunal Calificador de la Tesis: Marta Concheiro Guisán (presid.), Santiago Tomé Martínez de Rituerto (secret.), Ana Ferrer Dufol (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Avances y Nuevas Estrategias en Ciencias Forenses por la Universidad de Santiago de Compostela
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: MINERVA
- Resumen
- español
Los fármacos inmunosupresores son el tratamiento principal tras el trasplante de órgano sólido, siendo decisivos en la supervivencia del órgano trasplantado y del propio paciente tras el trasplante. Sin embargo, debido a su estrecho margen terapéutico y a su gran variabilidad farmacocinética inter e intrapaciente, la monitorización terapéutica de sus concentraciones (TDM) en sangre es crucial para, mediante el ajuste de las dosis, mantener las concentraciones de fármaco inmunosupresor dentro del margen terapéutico. La TDM rutinaria de los niveles de inmunosupresores se realiza en sangre (o plasma), empleando muestras obtenidas por venopunción, un procedimiento de recolección invasivo y que requiere de personal sanitario especializado para su recolección. En la presente Tesis Doctoral se han investigado dos alternativas a la venopunción, mínimamente invasivas: las técnicas de microsampling de sangre seca (en concreto, las gotas de sangre seca o DBS y las micromuestras de absorción volumétrica o VAMS) y las muestras de fluido oral. La hipótesis de partida de esta Tesis es, por tanto, que la TDM de inmunosupresores empleando muestras obtenidas por microsampling o muestras de fluido oral puede ser una alternativa fiable e incruenta a las matrices convencionales obtenidas por venopunción. Además, su aplicación hará más sencillo el control de la adherencia a los tratamientos, y la monitorización de la estrecha relación efectividad/toxicidad de estosfármacos, ahorrando asimismo muchos traslados a centros sanitarios, y contribuyendo, en definitiva, a mejorar la calidad de vida de los pacientes trasplantados. Por lo tanto, el principal objetivo de esta Tesis ha sido evaluar la utilidad de las técnicas de microsampling de sangre seca y las muestras de fluido oral como alternativas para la TDM de los principales fármacos inmunosupresores sujetos a seguimiento periódico de sus niveles en sangre (ciclosporina, everolimus, ácido micofenólico, sirolimus y tacrolimus). Para ello, se desarrollaron tres tipos de metodologías analíticas, altamente sensibles y precisas, basadas en el uso de la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS): los métodos de referencia (en sangre venosa y plasma), las metodologías en muestras de microsampling de sangre seca (DBS y VAMS) y la metodología en muestras de fluido oral.Todas las metodologías analíticas fueron validadas en función de los requerimientos específicos de cada una de ellas. Una vez completamente validadas, las metodologías fueron aplicadas al análisis de muestras reales de pacientes trasplantados hepáticos a seguimiento en el Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela (CHUS).En el caso de las técnicas de microsampling, se realizó una validación clínica para tacrolimus y ácido micofenólico en DBS y VAMS, comparando las concentraciones obtenidas en estas muestras con las obtenidas en las matrices convencionales mediante la aplicación de los test estadísticos adecuados. Se observó una alta correlación lineal en todos los casos y, después de la transformación de las concentraciones cuando fue necesario, se cumplieron los criterios de aceptación analíticos para los dos inmunosupresores en DBS y VAMS. Además, para tacrolimus en DBS se cumplieron los altamente exigentes requerimientos clínicos. Por otro lado, no se encontró ningún impacto significativo del hematocrito en la cuantificación de ningún analito. También se comparó el rendimiento de ambos tipos de técnicas de microsampling en función de los resultados obtenidos en las validaciones analítica y clínica, la calidad de la muestra recogida y el coste de los dispositivos, obteniéndose mejores resultados para las DBS. Por último, se realizó un estudio piloto para comprobar la aplicabilidad de estas metodologías en el contexto de la población real objeto de estudio.En el caso del fluido oral, se demostró la aplicabilidad de la metodología mediante el análisis de muestras reales, detectando las bajas concentraciones de inmunosupresores presentes en esta muestra biológica, y reportando por primera vez la determinación de everolimus en fluido oral. Además, se demostró la relevancia de utilizar un colector de fluido oral adecuado para garantizar la adecuada recuperación de los analitos.
- English
Immunosuppressive drugs are the main treatment following solid organ transplantation and are decisive for both graft and patient survival. However, due to their narrow therapeutic index and their big inter- and intra-patient pharmacokinetic variability, Therapeutic Drug Monitoring (TDM) of their concentrations in blood is crucial to maintain the immunosuppressive drug concentrations within their therapeutic levels by adjusting the doses.
Immunosuppressants TDM is routinely performed in blood (or plasma), using samples obtained by venipuncture, an invasive collection procedure that involves specialized sanitary staff. In this Doctoral Thesis, two minimally invasive alternatives to venipuncture have been investigated: dried blood microsampling techniques (specifically, Dried Blood Spots or DBS and Volumetric Absorptive Microsampling or VAMS) and oral fluid samples. The starting hypothesis of this Thesis is that immunosuppressants TDM, using samples obtained by microsampling or oral fluid samples, can be a reliable and noninvasive alternative to conventional matrices obtained by venipuncture. In addition, their application will make it easier to control adherence to treatments and to monitor the close effectiveness/toxicity relationship of these drugs, also saving many health center appointments and displacements, and ultimately contributing to improving the quality of life of transplanted patients.
Therefore, the main objective of this Thesis was to evaluate the usefulness of dried blood microsampling techniques and oral fluid samples as alternatives for TDM of the main immunosuppressive drugs subject to periodic monitoring of their blood levels (cyclosporin A, everolimus, mycophenolic acid, sirolimus and tacrolimus). For this, three types of highly sensitive and precise analytical methodologies were developed, based on the use of liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS): the reference methods (in venous blood and plasma), the methodologies in dried blood microsampling samples (DBS and VAMS) and the methodology in oral fluid samples. All analytical methodologies were validated based on the specific requirements of each of them. Once fully validated, the methodologies were applied to the analysis of real samples of liver transplant patients undergoing follow-up at the Santiago de Compostela University Hospital Complex (CHUS).
In the case of microsampling techniques, a clinical validation for tacrolimus and mycophenolic acid was carried out in DBS and VAMS, comparing the concentrations obtained in these samples with those obtained in conventional matrices by applying the appropriate statistical tests for the comparison of methods and the correct interpretation of the results obtained. A high linear correlation was observed in all cases and, after transformation of concentrations when necessary, analytical acceptance criteria were met for the two immunosuppressants in DBS and VAMS. Furthermore, for tacrolimus in DBS the highly demanding clinical requirements were also met. On the other hand, no significant impact of the hematocrit was found in the quantification of any analyte. The performance of both types of microsampling techniques was also compared based on the results obtained in the analytical and clinical validations, the quality of the collected samples and the cost of the devices, obtaining better results for DBS. Finally, a pilot study was carried out to verify the applicability of these methodologies in the context of the real population under study. In the case of oral fluid, the applicability of the method was demonstrated by analyzing real samples, detecting the low concentrations of immunosuppressants present in this biological matrix, and reporting everolimus determination in oral fluid for the first time. In addition, the relevance of using a suitable oral fluid collector to guarantee adequate recovery of analytes was also demonstrated.
- español
