Estudios estructurales y de interacción de miméticos de Condroitín Sulfato con los factores de crecimiento Midkina y Pleiotrofina

• Autores: Myriam Torres Rico
• Directores de la Tesis: Pedro Manuel Nieto Mesa (dir. tes.), José Luis de Paz Carrera (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2021
• Idioma: español
• Número de páginas: 247
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Idus
• Resumen

  • El Condroitín Sulfato es el glicosaminoglicano (GAG) más abundante en la matriz extracelular, cuyo patrón de sulfatación da lugar a diferentes estructuras que le confiere cierta afinidad con diversas proteínas, como factores de crecimiento, desencadenando distintos roles biológicos. El trabajo presentado en esta Tesis doctoral ha sido principalmente el estudio de interacción entre miméticos de Condroitín Sulfato (CS) con los factores de crecimiento de unión a Heparina, las citoquinas Midkina (MK) y Pleiotrofina (PTN). Dependiendo del código de sulfatación del CS se encuentran diferentes tipos, siendo el derivado de tipo E con unidades de Glc y GalNAc, el que establece uniones fuertes con este grupo de proteínas y con el que se ha trabajado en esta Tesis doctoral. Por lo tanto, los diferentes miméticos estudiados se engloban en dos series: tres ligandos tetrasacáridos y tres pentasacáridos de CS-E con diferentes patrones de sustitución, con los que posteriormente se desarrollarán los estudios de interacción con estas dos citoquinas. En primer lugar, se ha determinado la estructura de los seis miméticos por RMN utilizando principalmente la técnica 2D-NOESY, complementada con 2D-COSY, 2D-TOCSY y 2D-HSQC. Estos datos experimentales acerca de las conformaciones de los anillos y las orientaciones de los enlaces interglicosídicos han sido contrastadas paralelamente con cálculos computacionales de dinámica molecular, observándose que el patrón de sustitución en el ligando dificultaba su reproducibilidad teórica. La segunda parte de este proyecto consiste en estudiar la afinidad de estos miméticos con ambas proteínas observando si se establece dicha unión y que partes del carbohidrato y de la citoquina se encuentran involucradas. Mediante los experimentos de STD (Saturation Transfer Diffusion) y NOESY transferido se demostró que existía interacción deslocalizada por todo el esqueleto del oligosacárido, además de observarse que la estructura de los ligandos en su forma libre y enlazada no variaba. Paralelamente, la técnica de Polarización de Fluorescencia (FP) avaló esta interacción demostrando además que la presencia de sistemas aromáticos en el esqueleto del carbohidrato la aumentaba. Una vez observado el comportamiento del ligando en su forma complejada, nos planteamos estudiar dicha interacción desde la proteína. Para ello el experimento 15N-HSQC nos permitió conocer los aminoácidos más involucrados en esta interacción, realizando el experimento con el ligando más sencillo unido a la PTN. Por otro lado, se llevaron a cabo estudios de interacción teóricos para profundizar en el conocimiento de esta unión tanto con la MK como con la PTN. El docking molecular nos permitió ampliar las zonas de afinidad simulando otros bolsillos de interacción confirmando por otra parte las diferentes orientaciones que pueden adquirir los ligandos hacia estas citoquinas. Una vez conocida la estructura molecular de los seis miméticos en la primera parte del trabajo y la zona de mayor afinidad con la proteína, se amplían los cálculos teóricos al estudio del complejo para reproducir su estructura de nuevo mediante simulaciones. Por último, las aproximaciones MM/PBSA y MM/GBSA (Molecular Mechanics with Poisson-Boltzmann (PB) or Generalizated Born (GB) and Surface Area Solvation) permiten determinar los cambios de energía libre de unión de nuestros miméticos a estas proteínas conociendo además la participación de los aminoácidos a partir de simulaciones mediante modelos de solvatación.