Resumen de Desarrollo de métodos integrados para la determinación de biomarcadores genéticos
La detección selectiva y sensible de variaciones de nucleótido único es fundamental para el diagnóstico precoz, la terapia individualizada y el pronóstico de enfermedades. La pandemia SARS-CoV-2 ha puesto de manifiesto la necesidad acuciante de desarrollar métodos de detección fiables, rápidos y sencillos para el diagnóstico masivo. Asimismo, existe una demanda creciente de biosensores genómicos que sean selectivos, multianalito y de bajo coste y permitan detectar e identificar ciertos biomarcadores oncológicos.La presente tesis doctoral se ha centrado en el desarrollo de sistemas integrados de amplificación isoterma, hibridación selectiva y biosensado óptico para la detección de mutaciones puntuales en los genes PIK3CA, KRAS y BRAF asociadas al cáncer colorrectal. Estos biomarcadores predictivos se relacionan con un incremento de la proliferación celular, apoptosis y resistencia a tratamientos con anticuerpos monoclonales (Cetuximab y Panitumumab). En este contexto, se han explorado los métodos isotermos de amplificación de ADN, dado que son particularmente adecuados para el desarrollo de una nueva generación de dispositivos de diagnóstico dirigidos a apoyar la medicina de precisión. En concreto, se ha seleccionado la amplificación isoterma por recombinasa-polimerasa (RPA) como una alternativa a los métodos de detección que requieren de infraestructuras singulares. Además, se ha investigado su integración con plataformas bioanalíticas, lo que supone un gran avance para la simplificación de los procesos de biorreconocimiento y su detección óptica. Esta metodología ha presentado ventajas frente a otros sistemas de detección de ADN, en términos de portabilidad y equipos, así como reducción de tiempos de ensayo y la posibilidad de realizar las pruebas de diagnóstico fuera del laboratorio.
La presente tesis doctoral, enmarcada en este contexto, se estructura en 4 capítulos: En el capítulo 1 se presenta una nueva variante de la amplificación por recombinasa-polimerasa, denominada RPA-bloqueada, basado en el enriquecimiento de alelos minoritarios mediante de la introducción de un agente bloqueante. Además, en esta investigación se ha desarrollado un soporte analítico formado por un chip de policarbonato con sondas alelo-específicas ancladas covalentemente.La integración del método ha permitido desarrollar un sistema portátil para el genotipado simultáneo de mutaciones en los exones 9 y 20 del gen PIK3CA en líneas celulares y en tejidos tumorales de pacientes oncológicos. En el capítulo 2, se describe el desarrollo de un genosensor que incorpora partículas magnéticas conjugadas a sondas alelo-específicas para la concentración y detección del producto de amplificación selectivo derivado de la RPA-bloqueada. Con este genosensor, se han reducido los tiempos de hibridación y los volúmenes de reacción. Esta aproximación se ha concretado en un sistema portátil y de bajo coste para el genotipado del gen KRAS aplicable a muestras de tumores sólidos. Los capítulos 3 y 4 se centran en el desarrollo de superficies termoplásticas para el anclaje covalente de sondas alelo-específicas mediado por moléculas dendriméricas, con el objetivo de incrementar la densidad de inmovilización. Así, se ha estudiado el anclaje covalente a superficies termoplásticas de policarbonato y cicloolefina activadas, de sondas alelo-específicas, mediado por dendrímeros carboxílicos mediante la química de la carbodiimida y por dendrones mediante la reacción quimioselectiva del grupo tiol-ino. Dichos genosensores multiplexados han permitido el genotipado del codón V600 del gen BRAF y el codón H1047 del gen PIK3CA, en muestras de tejido biopsiado.
Las investigaciones desarrolladas en la presente tesis han dado lugar a nuevas aportaciones metodológicas de interés basadas en la obtención de sistemas biosensores integrados. Estas plataformas, contribuirán al desarrollo de herramientas de diagnóstico masivo.
