Lipoplex-mediated nanovectorization of nucleic acids in gene therapy

• Autores: Natalia Sánchez Arribas
• Directores de la Tesis: Andrés Guerrero Martínez (dir. tes.), Elena Junquera González (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2021
• Idioma: inglés
• Número de páginas: 314
• Títulos paralelos:
  • Nanovectorización de ácidos nucleicos mediada por lipoplejos en terapia génica
• Tribunal Calificador de la Tesis: Ana María Rubio Caparros (presid.), Eduardo Guzman Solis (secret.), Silvia Barbosa Fernández (voc.), Juan José Giner Casares (voc.), María Luisa Moyá Morán (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Química Avanzada por la Universidad Complutense de Madrid
• Materias:
  • Física
    • Química física
  • Química
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense
• Resumen
  • español

    La terapia génica se encarga del tratamiento de enfermedades a nivel molecular utilizando los ácidos nucleicos (NAs) como agentes terapéuticos. Según los NAs insertados, existen distintos mecanismos de acción. Los plásmidos de DNA (pDNAs) reemplazan el gen defectuoso para expresar el gen exógeno sano de interés, mientras que los pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) bloquean la síntesis de la proteína defectuosa silenciando los genes específicos correspondientes. Normalmente los NAs necesitan un agente transportador (vector) para su internalización en las células. Dentro de los posibles vectores no virales destacan los lípidos catiónicos (CLs) por su capacidad para interaccionar electrostáticamente con los NAs aniónicos y auto- organizarse espontáneamente en medio acuoso formando estructuras similares a las de la membrana celular. El complejo formado (lipoplejo) debe transportar y liberar los NAs en el citoplasma sin causar daños.

    Esta tesis doctoral trata de contribuir al desarrollo de nuevos vectores lipídicos para insertar NAs ahondando en diferentes aspectos de este proceso. Los objetivos fueron: 1. Desarrollar y caracterizar nanovectores lipídicos para transportar pDNAs o siRNAs. Para ello se seleccionaron distintos CLs (monovalentes, con una o dos cadenas hidrocarbonadas, o divalentes, como los lípidos catiónicos gemini) y se mezclaron con otros lípidos auxiliares no iónicos para mejorar la fusogenicidad del vector.

    2. Transfectar un gen terapéutico utilizando las formulaciones óptimas de nanovectores previamente estudiados. En concreto, se quiso transfectar un pDNA codificante de la interleukina-12, una citoquina influyente en la respuesta inmunitaria del organismo y con reconocida acción antitumoral.

    3. Analizar el perfil de proteínas con mayor afinidad por la superficie de los vectores estudiados. Esta corona de proteínas (PC) ofrece información relevante sobre la posible respuesta del organismo al nanovector.

    4. Controlar el proceso de liberación de NAs dentro de los nanovectores lipídicos utilizando las propiedades plasmónicas de las nanopartículas de oro (AuNPs) y radiación láser pulsada de femtosegúndo.

    Para alcanzar estos objetivos, se utilizó un enfoque multidisciplinar que agrupó desde la síntesis y caracterización biofísica de los vectores lipídicos hasta su estudio en entornos biológicos y la evaluación de su eficacia y viabilidad con estudios in vitro.

    La caracterización biofísica (electroquímica, estructural y computacional) permitió determinar las propiedades de los nanovectores. Las mezclas lipídicas propuestas lograron compactar y proteger los NAs formando distintas fases de cristal líquido liotrópico tras su interacción electrostática con los NAs. Los vectores fueron biocompatibles y eficaces en la inserción de pDNAs o siRNAs en las células, mejorando los valores obtenidos con el control (Lipofectamine2000*) en la mayoría de los casos.

    Se logró una transfección eficiente del gen terapéutico con los lipoplejos estudiados. Los niveles de interleukina-12 fueron incluso superiores a los obtenidos con el control en las células tumorales tratadas.

    La composición de la PC de los vectores fue muy similar pese a las diferencias estructurales de los lipoplejos estudiados. Además, se identificaron proteínas que podrían alargar el tiempo de circulación en sangre de los vectores, lo que les ayudaría a alcanzar su objetivo.

    Por último, se controló la liberación del pDNA de los lipoplejos gracias a las propiedades plasmónicas de las AuNPs añadidas a los vectores. La excitación de las AuNPs desestabilizó la membrana lipídica de los lipoplejos por calentamiento térmico y liberó los NAs.

    En definitiva, esta tesis ha supuesto un avance en los aspectos más críticos de la búsqueda de nanovectores seguros y eficaces para futuros tratamientos de terapia génica, como es la necesidad de utilizar genes terapéuticos desde los primeros ensayos, la caracterización detallada de la PC y la liberación controlada de los NAs.

  • English

    Gene therapy is a very promising branch of biomedicine that aims to treat inherited or acquired diseases (such as cancer, cardiovascular, neurological and inflammatory diseases) at molecular level. The purpose is to restore correct cell function using nucleic acids (NAs) as therapeutic agents. Depending on the NAs inserted, there are different mechanisms of action. For instance, plasmids DNA (pDNAs) use the patient's biological machinery to replace the defective gene and express the healthy exogenous gene of interest. Other NAs, such as small interfering RNAs (siRNAs), prevent the synthesis of the pathogenic protein by knockdown the corresponding genes. In most cases, NAs require a carrier agent, known as vector, for their internalization into the target cells. Viruses were the source of inspiration during the early stages of gene therapy for the insertion of NAs into cells. Nowadays, viral vectors are still in use due to their high efficiency; however, the undesirable adverse effects associated with their use are forcing the search for alternatives. Among the different synthetic options for non-viral vectors, polymeric and colloidal systems stand out. Within colloidal systems, cationic lipids (CLs) are perhaps the most studied group due to their ability to interact electrostatically with anionic NAs, and spontaneously self-organize in aqueous solution forming structures similar to that of the cell membrane. The resulting complex between the CLs and NAs, well-known as lipoplex, must transport the NAs into cells and release them into the cytoplam without causing damage. The efficiency of this process will depend on the vector’s capacity to overcome the known biological barriers during its physiological journey...