Resumen de Development of an in-vitro diagnostic system for food allergies. Desarrollo de un sistema de diagnóstico in-vitro para alergias alimentarias
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RESUMEN El diagnóstico de alergia alimentaria es un campo controvertido, puesto que existe una falta de estandarización en las metodologías y no hay acuerdo entre los clínicos especialistas sobre cuál es la más adecuada. Esta tesis propone un nuevo dispositivo de diagnóstico in-vitro para la detección de alergias alimentarias basado en la detección de inmunoglobulinas E (IgE) en suero. Las características específicas de la IgE, su comportamiento tras la reacción alérgica, su baja concentración y la interferencia de otras biomoléculas la convierte en una molécula objetivo difícil de detectar. Las dificultades técnicas a las que se enfrenta un nuevo dispositivo de diagnóstico en este campo quedan reflejadas en la gran cantidad de dispositivos de diagnóstico que se han encontrado en el mercado, así como en el número de sistemas aún en desarrollo. Ninguno de ellos satisface las necesidades expuestas por los alergólogos, por lo que se siguen buscando alternativas que mejoren los dispositivos actuales.
El sistema propuesto ha sido desarrollado en el marco de un proyecto europeo, y en coordinación con varios de los socios de dicho proyecto. El trabajo descrito en la tesis abarca desde la etapa de fabricación de los transductores, hasta la fase experimental y primera propuesta de validación pre-clínica.
El biosensor óptico utilizado es un interferómetro de Fabry-Perot que puede ser interrogado verticalmente en un formato sin marcaje. Dicho sensor se ha adaptado a diferentes diseños y configuraciones, con el objetivo de conseguir una detección múltiple. La versión final es un biosensor multiplexado capaz de medir por triplicado 22 reactivos diferentes. El proceso de control de calidad establecido garantiza la calidad de los biosensores desde la fabricación hasta el paso de biofuncionalización. El sistema de lectura ha sido desarrollado y optimizado por BiOD s.l, consiguiendo una reducción de los tiempos de medida considerables. Para cumplir con los requisitos del sistema propuesto, se ha seguido la Metodología de Detección Óptica Interferométrica (Interferometric Optical Detection Method, IODM) patentada por el Grupo de Óptica, Fotónica y Biofotónica de la Universidad Politécnica de Madrid. Los resultados de las pruebas intermedias han sido comparados y corroborados con algunas técnicas establecidas a nivel mundial, como ELISA y microscopía electrónica de barrido (SEM). Además, en concreto, se realizó una comparación con uno de los sistemas más extendidos para el diagnóstico de alergias alimentarias, el ImmunoCAPTM (obteniendo unos límites de detección similares a los del ImmunoCAPTM). Por último, se han realizado muchos esfuerzos para lograr una configuración fácil de usar, por lo que los dispositivos periféricos también se han ajustado para que sean fácilmente manejables.
La baja concentración de IgE, principalmente en comparación con otras inmunoglobulinas (Igs), reduce considerablemente la sensibilidad de los sistemas basados en la detección de IgE. Así, durante el curso de esta tesis se ha planteado una metodología de amplificación refractométrica basada en el uso de nanopartículas (NPs). La metodología, que ha sido patentada, se propuso para, por un lado, amplificar la señal de lectura, y por otro, para resolver el efecto de la matriz, mediante la separación física la IgE de otras inmunoglobulinas. Esta metodología fue usada en una prueba de concepto con un único alérgeno, y obtuvo resultados prometedores. Por tanto, se realizaron nuevos inmunoensayos en formato multiplexado con suero de pacientes alérgicos. Se mostró así la potencialidad del sistema, y las conclusiones obtenidas sirvieron para indicar algunas líneas de trabajo futuro que permitieran optimizar protocolos y mejorar resultados en el diagnóstico de alergia alimentaria.
Finalmente, la posibilidad de personalizar el biosensor, de adaptar los protocolos de experimentación y la metodología de amplificación, y el método de lectura directo, sin necesidad de revelado, convierten al sistema desarrollado en una atractiva alternativa a otros sistemas de diagnóstico. La capacidad de contener diferentes biorreceptores permite la medición de diferentes biomarcadores y, por lo tanto, el mismo sensor puede medir diferentes enfermedades. Tal versatilidad aumenta el impacto de este sistema en los Servicios de Salud, ya que la misma plataforma de lectura podría usarse para medir varias enfermedades, si los biosensores y los protocolos son específicos para cada una.
- English
ABSTRACT Food allergy diagnosis is a controversial field with a lack of standardization and with no agreement among clinicians about the best methodology to use. This thesis comprises the proposal of a new in-vitro device to help in the diagnosis of food allergies by detecting immunoglobulin E (IgE) in serum. The specific features of IgE, its behaviour after the allergic reaction, its low concentration, and the interference of other biomolecules when detecting food allergy make IgE a challenging target molecule to detect. The technical difficulties faced by a new diagnostic device in this field are reflected in the large number of diagnostic devices which have been found on the market, and those under development. None of them meets the needs expressed by allergists, so alternatives to improve current devices are still being researched.
The proposed system has been fully developed in coordination with partners of a European project, and the work described in this thesis goes from the biosensor fabrication stage up to the experimental phase and clinical first approach.
The optical biosensor used is a Fabry-Perot interferometer, which can be vertically interrogated in a label-free format. It has been adapted to different layouts and configurations pursuing the multiplexation of the measurements. The final version is a multiplexed biosensor able to measure 22 different reagents in triplicates. The established Quality Control process ensures the quality of the biosensors from the fabrication up to the biofunctionalization step. The readout system has been developed by BiOD s.l. and adjusted to reduce the timing of measurements. The Interferometric Optical Detection Methodology (IODM) patented by the Group of Optics, Photonics and Biophotonics of the Universidad Politécnica de Madrid has been followed to fulfill the requirements of the proposed system. Intermediate proofs of concept were tested and validated by comparing and corroborating results with some internationally recognized techniques, such as ELISA and scanning electronic microscopy (SEM). Specifically, the label-free methodology was compared with the ImmunoCAPTM system, one of the most extended systems for food allergy diagnosis, obtaining a LoD close to the ImmunoCAPTM one. Finally, many efforts have been made to pursue a user-friendly setup; thus, the peripherical gadgets have also been tuned to be handy.
The disadvantage of the low concentration of IgE, mainly in comparison with other Immunoglobulins (Igs), reduces the sensitivity of the systems based on the detection of IgE as a target molecule. Thus, within this thesis an amplification refractometric methodology based on the use of nanoparticles (NPs) has been developed and patented. The methodology was proposed to amplify the readout signal and to solve the matrix effect by physically separating IgE from other immunoglobulins. It was tested for the first time in a proof-of-concept with one allergen with promising results. Therefore, new immunoassays were performed in a multiplexed format with serum from allergic patients. The potentiality of the system was shown and some future lines were pointed out to optimize protocols and improve results in food allergy diagnosis.
Finally, the specific features of the system developed (i.e., the biosensor and amplification methodology, their ad-hoc customizability, and the features of the readout platform) resulted in an alternative to the diagnosis of several diseases. The capability of holding different bioreceptors allows the measurement of different biomarkers, and therefore of different diseases. Such versatility increases the impact of this system on the Health Services as the same reading platform could be used to measure several diseases provided that the biosensors and protocols are specified for such bioapplication.
