Desarrollo de técnicas de citometría de flujo para la modificación dirigida de la microbiota y el estudio de la función biológica de bacterias intestinales
- Autores: Raquel Marcos Fernández
- Directores de la Tesis: Abelardo Margolles (dir. tes.), Borja Sánchez García (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Oviedo ( España ) en 2021
- Idioma: español
- Materias:
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- Resumen
La microbiota intestinal se define como el conjunto de microorganismos que habitan en el intestino humano. Proporciona al hospedador una serie de beneficios, destacando su función de barrera frente a microorganismos patógenos, el aprovechamiento de la energía de alimentos no digeribles y su contribución a la maduración y desarrollo del sistema inmune. Determinados factores pueden provocar cambios en las poblaciones de nuestra microbiota intestinal que acarrean consecuencias para la salud como procesos inflamatorios, enfermedades autoinmunes o cáncer.
El objetivo general de esta tesis doctoral es aplicar técnicas de citometría de flujo y separación celular para la modificación dirigida de la microbiota intestinal y estudiar la función biológica de bacterias intestinales como Lacticaseibacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Escherichia coli pks+ y Faecalibacterium prausnitzii. Los resultados obtenidos han permitido desarrollar un método que ha contribuido a comprender la función biológica de una especie bacteriana específica sobre una determinada enfermedad.
Durante la primera etapa de esta tesis se desarrollaron metodologías y protocolos de marcaje de bacterias y separación inmunomagnética, para aislar y eliminar una bacteria especifica presente en una comunidad microbiana. El protocolo de marcaje de bacterias se realizó con un anticuerpo monoclonal y otro policlonal dirigidos a la hidrolasa de pared celular de Lacticaseibacillus rhamnosus. Una vez optimizado el protocolo se llevó a cabo el primer ensayo de separación inmunomagnética en microbiotas intestinales sintéticas y complejas suplementadas con Lactobacillus acidophilus. Para ello, se utilizó un anticuerpo policlonal dirigido a la proteína A de la capa S de esta bacteria. Las fracciones deplecionadas y enriquecidas fueron analizadas mediante citometría de flujo y metataxonómica. Las fracciones enriquecidas, además, fueron sembradas y los aislados obtenidos se identificaron mediante secuenciación del ADN ribosomal 16S. Los resultados de metataxonómica mostraron enriquecimientos desde 40 hasta 1000 veces en L. acidophilus con respecto a la fracción deplecionada.
Posteriormente, se realizó un estudio de detección y eliminación de cepas de E. coli pks+ de microbiotas intestinales de donantes sanos utilizando cuatro anticuerpos policlonales dirigidos a una proteína transmembrana. El anticuerpo anti-péptido 2 mostró mayor especificidad en la detección de pks+, y por ello fue utilizado en las separaciones magnéticas. Los aislados obtenidos en la fracción enriquecida fueron sembrados e identificados mediante secuenciación del ADN ribosomal 16S. La presencia del clúster de la colibactina fue determinada mediante PCR utilizando cebadores específicos. Además, se secuenciaron los genomas de 14 aislados para verificar la presencia de la isla pks.
En el último trabajo de esta tesis doctoral se desarrolló un anticuerpo policlonal dirigido a la superficie celular de F. prausnitzii. Con esta metodología, se redujo la población de F. prausnitzii de microbiotas intestinales de donantes sanos y se enriqueció con F. prausnitzii la microbiota de donantes con enfermedad de Crohn. Finalmente, se realizaron estudios in vitro donde se estudió la interacción de las diferentes microbiotas con células mononucleares de sangre periférica con el objetivo de estudiar el mecanismo de acción de F. prausnitzii. Los resultados revelaron que la microbiota enriquecida baja la producción de citocinas proinflamatorias como la IL-1β y el TNF-α con respecto a la microbiota de Crohn y a la microbiota sana.
Esta tesis doctoral aporta una novedosa contribución en las aplicaciones de la citometría de flujo y en el estudio de la función biológica de bacterias intestinales. Los resultados muestran que la modificación dirigida de la microbiota podría utilizarse para tratar distintas enfermedades como la enfermedad inflamatoria intestinal.
