Nueva estrategia para el descubrimiento y desarrollo de fármacos leishmanicidas
- Autores: Bárbara Domínguez Asenjo
- Directores de la Tesis: Rafael Balaña Fouce (dir. tes.), Rosa María Reguera Torres (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de León ( España ) en 2021
- Idioma: español
- Número de páginas: 105
- Títulos paralelos:
- New Strategy for Antileishmanial Drug Discovery and Development
- Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Javier Moreno Nuncio (presid.), Salvador Iborra Martín (secret.), Félix Calderón Romo (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina y Ciencias de la Salud por la Universidad de León
- Materias:
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- Resumen
La leishmaniasis es un grupo de enfermedades causadas por al menos 20 especies del género Leishmania. Esta enfermedad es esencialmente una enfermedad zoonótica, trasmitida por flebótomos del género Lutzomya en América, y del género Phlebotomus en África, Asia y Europa. La leishmaniasis cutánea, causada por L. major y L. braziliensis, se caracteriza por la aparición de una o varias úlceras en el sitio de la picadura. Aunque estas lesiones habitualmente curan espontáneamente causan cicatrices y desfiguraciones que provocan una estigmatización social y problemas psicológicos. Sin embargo, la leishmaniasis visceral, causada por L. donovani y L. infantum, se caracteriza por hepatoesplenomegalia, fiebre, pérdida de peso y pancitopenia. La LV en ausencia de tratamiento resulta fatal, se estima que causa la muerte de entre 20.000 y 40.000 personas al año.
Los fármacos en los que se basa el tratamiento de la leishmaniasis poseen graves limitaciones; son inseguros, ineficaces en determinadas zonas geográficas por la aparición de resistencias y dependen mayoritariamente de la administración parenteral; lo que dificulta la adherencia al tratamiento y obliga a la hospitalización del paciente. Aunque el desarrollo de nuevos fármacos activos frente a Leishmania spp. ha tenido un importante impulso en los últimos años, gracias al desarrollo de nuevas tecnologías de bioimagen y a la incorporación de parásitos transgénicos, la baja predictibilidad de los métodos empleados en los cribados in vitro ha provocado que el porcentaje de compuestos descubiertos sea inferior al esperado.
El reposicionamiento de fármacos es una estrategia bien establecida en el descubrimiento y desarrollo de medicamentos, cuyo objetivo es encontrar un nuevo uso a un fármaco ya aprobado por las agencias reguladoras y reducir así el tiempo y el coste necesarios para su comercialización. En una enfermedad desatendida como la leishmaniasis, en la que no solo se necesitan urgentemente nuevos tratamientos, sino que estos deben ser asequibles, el reposicionamiento de fármacos es una aproximación muy apropiada de hecho, el 62,5% de los fármacos actuales, como por ejemplo la anfotericina B, la miltefosina y la pentamidina fueron inicialmente utilizados como agentes antifúngicos, anticancerígenos y antimicrobianos, respectivamente.
Con el objetivo de acelerar el descubrimiento de nuevos fármacos frente a este parásito hemos desarrollado una estrategia alternativa basada en: I) el cribado fenotípico de compuestos en un sistema que utiliza explantes esplénicos de ratones infectados y II) la evaluación de la eficacia in vivo de los compuestos seleccionados en un modelo murino de leishmaniasis cutánea y mediante imagen en tiempo real en un modelo murino de leishmaniasis visceral.
Llevamos a cabo el cribado ex vivo de 1769 compuestos, procedentes de dos librerías de compuestos aprobados mayoritariamente por la EMA y la FDA (Anti-Infection Compound Library (MedChemExpress) y Prestwick Chemical Library), en explantes esplénicos de ratones Balb/c infectados con L. infantum. Tras dos rondas selectivas a 10 y 1 µM, se identificaron compuestos que habían pasado desapercibidos para otros autores que llevaron a cabo el cribado en macrófagos infectados in vitro. El explante, a diferencia de estas infecciones in vitro, es un modelo más próximo a la infección natural y permite identificar los compuestos con actividad frente a Leishmania spp. dentro del ambiente inmunopatológico de un hospedador infectado durante semanas por el parásito.
Una de las ventajas de seguir la estrategia del reposicionamiento de fármacos es que disponemos de los perfiles farmacocinéticos de la mayoría de los compuestos testados por lo que fácil y rápidamente pudimos salvar la brecha entre los ensayos in vitro y los ensayos in vivo y evaluar aquellos compuestos con un buen índice selectivo y propiedades farmacocinéticas adecuadas en modelo de leishmaniasis visceral crónica desarrollado previamente: salinomicina, docetaxel, paclitaxel y nifuratel.
Nuestro modelo de leishmaniasis visceral crónica se basa en la infección de ratones Balb/c con altas dosis de promastigotes estacionarios de la cepa L. donovani (MHOM/ET/67/HU3), modificada genéticamente para que exprese la luciferasa PpyRE9h y que tras la administración del sustrato (D-luciferina) emitan luz. El sistema de imagen in vivo que hemos desarrollado nos ha permitido evaluar longitudinalmente, en tiempo real y sin necesidad de sacrificar a los animales, la fase aguda y crónica de la leishmaniasis visceral e identificar el timo como un órgano diana de las infecciones por L. donovani. La infección del timo por L. donovani se observó desde el inicio y permaneció estable a los tiempos estudiados. Los amastigotes de L. donovani fueron localizados en la médula del timo, como cabría esperar ya que la corteza del timo está aislada de la circulación sanguínea por la barrera hematotímica.
Además, dado que la bioluminiscencia in vivo detectada en las regiones de interés se correlacionó con la carga parasitaria cuantificada por qPCR, nos permitió evaluar la actividad leishmanicida in vivo de los cuatro compuestos seleccionados. El tratamiento con salinomicina, docetaxel y paclitaxel no redujo significativamente la señal bioluminiscente. Sin embargo, la administración por vía oral de 50 mg/kg de nifuratel dos veces al día durante 10 días consiguió eliminar casi el 90% de la carga parasitaria en el bazo, el 97% en timo y casi un 70% en hígado. En cuanto al tratamiento con nifuratel de la leishmaniasis cutánea, su administración intralesional produjo la cura parasitológica, tanto en el sitio de la lesión como en el ganglio que la drena, apuntando a la baja biodisponibilidad del nifuratel en el hígado y en el bazo como la causa de la no erradicación del parásito en estos órganos.
Ante los múltiples fracasos en el desarrollo de fármacos frente a esta enfermedad, otra aproximación que se ha planteado es encapsular aquellos fármacos con baja biodisponibilidad o efectos secundarios en nanopartículas, con el fin de solventar sus limitaciones e incrementar su eficacia y seguridad in vivo.
Aunque existen muchos tipos de nanopartículas, nosotros proponemos aprovecharnos del hecho de que la infección por Leishmania spp. promueve la polarización de los macrófagos al fenotipo M2, caracterizado por la sobreexpresión del receptor de manosa (CD206) y dirigir la nanopartícula específicamente a los macrófagos infectados decorando su superficie con moléculas de manosa. Los resultados obtenidos in vitro demuestran que efectivamente, esta nanopartícula es endocitada preferentemente por los macrófagos infectados y que es capaz de llegar hasta el amastigote, liberar el fármaco y eliminar al parásito.
