Implicación del metabolismo bacteriano en la interacción de Haemophilus influenzae con el sistema respiratorio humano: bases moleculares y explotación terapéutica

• Autores: Nahikari López López
• Directores de la Tesis: Junkal Garmendia (dir. tes.), Roberto Diez Martínez (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Pública de Navarra ( España ) en 2022
• Idioma: español
• Número de páginas: 464
• Tribunal Calificador de la Tesis: José Luis Martínez Menéndez (presid.), Sara Marti Marti (secret.), Virginia Aragón Fernández (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biotecnología por la Universidad Pública de Navarra
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología celular
      • Cultivo celular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Academica-e
• Resumen
  • español

    Este trabajo de Tesis Doctoral aborda el papel de tres aspectos del metabolismo bacteriano (síntesis de purinas, catabolismo de glucosa, síntesis de ácidos grasos) en la interacción entre el patógeno Haemophilus influenzae no tipificable (HiNT) y el sistema respiratorio humano. Mediante análisis de expresión génica global, inactivación génica y caracterización fenotípica in vitro e in vivo, modelado computacional, química médica, y evaluación antimicrobiana a nivel preclínico, estudiamos los perfiles transcripcionales de patógeno y hospedador durante la infección respiratoria (Capítulo 2), la contribución del catabolismo de glucosa en la patogénesis de H. influenzae (Capítulo 3), y el potencial antimicrobiano de la inhibición de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos de esta bacteria (Capítulo 4). H. influenzae fue el primer organismo de vida libre cuyo genoma completo fue secuenciado, haciéndolo pionero en el desarrollo y empleo de técnicas -ómicas. El Capítulo 1 de este trabajo ha revisado la contribución de abordajes -ómicos incluyendo genómica, transcriptómica, proteómica y metabolómica, al estudio de la interacción entre HiNT y el sistema respiratorio humano. En el Capítulo 2 de este trabajo realizamos un estudio multi-ómico in vivo, consistente en la utilización de RNA-seq dual y Tn-seq durante el proceso de infección respiratoria murina por HiNT. El perfil de expresión génica diferencial entre bacterias cultivadas in vitro y bacterias recuperadas de lavado broncoalveolar murino mostró la sobre-expresión de genes que codifican enzimas implicadas en la síntesis de purinas y aminoácidos, así como de genes que codifican parte de la maquinaria de competencia natural de la bacteria. El aumento de los niveles de glucosa en las vías respiratorias de pacientes que sufren enfermedades respiratorias crónicas facilita la proliferación de patógenos que metabolizan este azúcar. HiNT cataboliza glucosa mediante una fermentación asistida por respiración que conlleva la excreción de acetato, formato y succinato. En el Capítulo 3 de este trabajo, diseñamos, generamos y caracterizamos un panel de cepas mutantes que no producen acetato, formato o succinato mediante la inactivación de los genes ackA, pflA y frdA, respectivamente. La inactivación de ackA limitó la producción de acetato y el crecimiento bacteriano, y estimuló tanto la producción de lactato en anaerobiosis como la atenuación bacteriana in vivo. El acetato excretado estimuló la expresión de genes pro-inflamatorios en células de epitelio respiratorio en cultivo, lo que sugiere que el catabolismo de glucosa contribuye no sólo al crecimiento de HiNT sino también a la inmunomodulación del sistema respiratorio humano. La resistencia de H. influenzae a antibióticos β-lactámicos ha llevado a su inclusión en la lista de patógenos bacterianos para los que la OMS considera prioritaria la búsqueda y desarrollo de nuevos antimicrobianos. En el Capítulo 4 de este trabajo, desarrollamos y validamos un modelo metabólico de H. influenzae a escala genómica, que utilizamos como herramienta de escrutinio in silico de genes esenciales de este patógeno, para su explotación como dianas terapéuticas. Este modelo predijo la esencialidad de un gran número de genes implicados en la síntesis de lípidos. Nos centramos en la enzima FabH, que cataliza la condensación descarboxilativa de malonil-ACP y acil-CoA en la iniciación de la biosíntesis de ácidos grasos. Nuestro modelado computacional mostró la idoneidad de la interacción de la molécula ácido 1- (5- (2-fluoro-5- (hidroximetil) fenil) piridin-2-il) piperidin- 4-acético y la proteína FabH. Este inhibidor redujo la viabilidad bacteriana de forma dosisdependiente. El efecto inhibitorio observado fue variable entre aislados clínicos portadores de distintas variantes alélicas del gen fabH, e independiente de su expresión. El inhibidor empleado no generó sinergias, no favoreció el desarrollo de resistencias, y no alteró la dinámica de infección epitelial por HiNT, mostrado además un efecto protector frente a la infección por HiNT in vivo. En conjunto, este trabajo de Tesis Doctoral proporciona conocimiento nuevo sobre el papel del metabolismo bacteriano en la interacción HiNT-sistema respiratorio humano, que esperamos sea de utilidad en el desarrollo de estrategias anti-infectivas que mejoren el manejo clínico de las enfermedades infecciosas asociadas a este patógeno.

  • English

    This PhD Thesis work addresses the role of three aspects of bacterial metabolism (purine synthesis, glucose catabolism, fatty acid synthesis) in the interaction between nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) and the human airways. Global gene expression analysis, gene inactivation and phenotypic characterization in vitro and in vivo, computational modeling, medical chemistry, and antimicrobial evaluation at the preclinical level, led us to study pathogen and host transcriptional profiles during respiratory infection (Chapter 2), the contribution of glucose catabolism to H. influenzae pathogenesis (Chapter 3), and the antimicrobial potential of inhibiting this bacterial fatty acid biosynthesis pathway (Chapter 4). H. influenzae was the first free-living organism whose genome was fully sequenced, thus pioneering in the development and use of -omics techniques. Chapter 1 of this work reviewed the contribution of -omic approaches including genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics, to the study of this host-pathogen interplay. In Chapter 2, we carried out an in vivo multi-omic study, using dual RNA-seq and Tn-seq during murine respiratory infection by NTHi. Differential gene expression profiling of bacteria grown in vitro compared to those recovered from murine bronchoalveolar lavage fluid samples showed overexpression of genes that encode enzymes involved in purine and amino acids synthesis, as well as of genes encoding part of the bacterial natural competence machinery. The increase of glucose levels in the respiratory tract of patients suffering chronic respiratory diseases facilitates the proliferation of pathogens able to metabolize this sugar. NTHi catabolizes glucose through respiration-assisted fermentation involving the excretion of acetate, formate, and succinate. In Chapter 3 of this work, we designed, generated, and characterized a panel of mutant strains that did not produce acetate, formate, or succinate by inactivating the ackA, pflA, and frdA genes, respectively. Inactivation of the ackA gene limited acetate production and bacterial growth, and stimulated both anaerobic lactate production and bacterial attenuation in vivo. The excreted acetate stimulated the expression of pro-inflammatory genes by cultured respiratory epithelial cells, which suggests that glucose catabolism contributes not only to the growth of NTHi but also to immunomodulation within the human respiratory system. The H. influenzae resistance to β-lactam antibiotics led to its inclusion in the list of bacterial pathogens for which the WHO considers a priority the search and development of new antimicrobials. In Chapter 4 of this work, we developed and validated a H. influenzae genome-scale metabolic model, which we used as an in silico screening tool to identify bacterial essential genes suitable as therapeutic targets. This model predicted the essentiality of a large number of genes involved in lipid synthesis. We focused on the enzyme FabH, which catalyzes the decarboxylative condensation of malonyl-ACP and acyl-CoA in the initiation of fatty acid biosynthesis. Computational modeling showed the suitability of the interaction of the chemical inhibitor 1- (5- (2-Fluoro-5- (hydroxymethyl) phenyl) pyridin-2-yl) piperidine-4-acetic acid with FabH. Likewise, this inhibitor reduced bacterial viability in a dose-dependent manner. The inhibitory effect observed was variable among clinical isolates carrying different allelic variants of the fabH gene, and independent of this gene expression. The inhibitor did not generate synergies, did not favor the development of resistance, and did not alter the dynamics of epithelial infection by NTHi. Notably, this chemical inhibitor showed a protective effect against NTHi infection in vivo. Altogether, this PhD Thesis work provides novel knowledge on the role of bacterial metabolism in the NTHi-human respiratory system interplay, intended to be useful in the development of antiinfective strategies that will improve the clinical management of infectious diseases associated to this pathogen.