Estructura e interacciones de dominios funcionales del arn del virus de la hepatitis c
- Autores: Jesús Castillo Martínez
- Directores de la Tesis: Jose Gallego Sala (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir ( España ) en 2021
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Carlos González Ibáñez (presid.), Santiago Ramon Maiques (secret.), Adolfo García Sastre (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Ciencias de la Vida y del Medio Natural por la Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
- español
El virus de la hepatitis C (VHC) afecta a 71 millones de personas en todo el mundo y es una de las principales causas de cirrosis y cáncer hepático. El ARN genómico del VHC comprende un único marco abierto de lectura (ORF, en sus siglas en inglés) flanqueado a ambos lados por regiones no traducidas (UTR, en sus siglas en inglés) que contienen secuencias estructuradas esenciales para los procesos de traducción, replicación e infectividad. En concreto, el dominio 3’X de 98 nucleótidos, localizado en el extremo 3’ del genoma del virus, contiene dos secuencias altamente conservadas: DLS (Dimer Linkage Sequence, en inglés), que permite la dimerización del ARN viral in vitro, y k, responsable de la interacción con el subdominio 5BSL3.2, situado en el ORF.
Resultados previos indicaron que el dominio 3’X adopta una conformación constituida por dos horquillas estabilizadas por apilamiento coaxial que expone la secuencia DLS en un bucle apical, pero entierra la secuencia k en una doble hélice. Esta conformación permite al dominio formar homodímeros mediante la secuencia palindrómica DLS y también, sorprendentemente, interaccionar con 5BSL3.2.
En esta tesis doctoral hemos analizado la estructura y la función del dominio 3’X, el subdominio 5BSL3.2 y el complejo distal 3’X-5BSL3.2, mediante experimentos de espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN), dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS, en sus siglas en inglés), desnaturalización térmica y electroforesis, combinados con mutagénesis y ensayos funcionales. Los resultados indicaron que el dominio 3'X adquiere una conformación tridimensional significativamente estable, formada por dos horquillas (SL1’ y SL2’) apiladas coaxialmente; las mutaciones del dominio 3’X que perturbaron esta conformación produjeron efectos negativos, tanto en la capacidad de interacción con el subdominio 5BSL3.2 como en los procesos de replicación y traducción del ciclo del VHC. El subdominio 5BSL3.2, por otra parte, adoptó una estructura tridimensional muy estable con forma de “L”, similar a la de dominios de ARN conservados de Flavivirus importantes para el proceso de replicación. El complejo entre 3’X y 5BSL3.2 formó una estructura inusual, consistente en una intersección de besos con forma de “Y” cuyo eje inferior correspondía al subdominio SL1’ y la doble hélice basal de SL2’, y cuyos dos ejes superiores estaban compuestos por el subdominio 5BSL3.2 y una nueva horquilla de 17 nucleótidos formada por nucleótidos DLS liberados por la interacción. La conformación doblada en “L” del subdominio 5BSL3.2 y su capacidad para interaccionar con la polimerasa NS5B, la presencia de una única estructura del dominio 3’X compuesta por dos horquillas que libera los tres nucleótidos terminales del genoma viral, y la alta estabilidad del complejo 3’X-5BSL3.2 y su capacidad para bloquear la secuencia DLS, nos ha permitido proponer un modelo de regulación del ciclo viral. En este modelo, la interacción 3’X-5BSL3.2 favorece el proceso de traducción y reprime la replicación del ARN viral, mientras que la interacción de 5BSL3.2 con NS5B y la formación de homodímeros 3’X-3’X posiblemente favorecen el inicio de la síntesis de la cadena de ARN vírico de sentido negativo.
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ABSTRACT Hepatitis C virus (HCV) affects 71 million people and is one of the leading causes of cirrhosis and liver cancer worldwide. The genomic RNA of HCV comprises a single open reading frame (ORF) flanked at both ends by untranslated regions (UTRs) containing structured regions essential for translation, replication and infectivity. In particular, the 98-nucleotide 3’X domain located at the 3' end of the viral genome contains two overlapped, highly conserved sequences: DLS (Dimer Linkage Sequence), which drives genome dimerization, and k, responsible for the interaction with subdomain 5BSL3.2 in the ORF.
Previous results showed that 3’X domain adopts a two stem-loop structure stabilized by coaxial stacking, where the DLS palindrome is exposed in an apical loop and the k sequence embedded in a double-helical stem. This conformation allows the 3’X domain to form homodimers through the DLS and, surprisingly, to also interact with 5BSL3.2.
In this thesis, we have analysed the structure and function of domain 3’X, subdomain 5BSL3.2 and the distal complex formed by 3’X and 5BSL3.2 using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, small angle X-ray scattering (SAXS), UV-monitored thermal melting and electrophoretic experiments, combined with mutagenesis and functional assays. The results indicated that domain 3’X acquired a significantly stable conformation formed by two coaxially-stacked hairpins (SL1’ and SL2’). 3’X domain mutations disturbing this structure produced negative effects in 5BSL3.2 binding capacity as well as viral replication and translation. The 5BSL3.2 subdomain, on the other hand, adopted a highly stable “L”-shaped three-dimensional conformation, similar to conserved RNA domains present in Flavivirus and essential for replication. The complex between 3’X and 5BSL3.2 formed a highly unusual, “Y”-shaped kissing-junction structure. The lower branch of the “Y” corresponded to SL1’ and the lower stem of SL2’, and the two upper branches were formed by 5BSL3.2 and a new 17-nucleotide hairpin containing DLS residues released by the interaction. The L-shaped structure acquired by the 5BSL3.2 subdomain and its ability to interact with the NS5B viral polymerase, the presence of a single 3'X domain conformation comprising two hairpins and exposing the three terminal nucleotides of the viral genome, and the high stability of the 3’X-5BSL3.2 complex and its capacity to block the DLS sequence, allowed us to propose a model of regulation of the viral cycle by these structures. In this model, the 3’X-5BSL3.2 distal contact favours translation and represses viral RNA replication, whereas the interaction between 5BSL3.2 and NS5B and the formation of 3’X-3’X homodimers likely favour the initiation of negative-sense viral RNA synthesis.
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