Resumen de Implicacions fisiopatològiques de l’alteració del transportador concentratiu de nucleòsids hcnt1
L’entrada de nucleòsids a la cèl·lula està regulada pels transportadors concentratius de nucleòsids (hCNTs, família gènica SLC28) i transportadors equilibratius de nucleòsids (hENTs, família gènica SLC29). S’ha descrit que l’expressió dels hCNTs disminueix en càncer, sobretot hCNT1. La restitució d’hCNT1 en models tumorals indueix canvis a la cèl·lula de caràcter supressor de tumor, i es donen independentment de la seva capacitat transportadora; per aquest motiu està classificat com a transceptor. Així, s’ha hipotetitzat que la desregulació d’hCNT1 és un esdeveniment primerenc en el procés de carcinogènesi. Per tant, l’objectiu principal d’aquesta tesi és elucidar els mecanismes de regulació d’hCNT1.
Es va estudiar la base genètica de l’uridina-citidinúria en un pacient que presentava febre, hepatosplenomegàlia, acidosi làctica persistent, alteracions dels enzims hepàtics i que finalment va morir per fallada multiorgànica. Es van identificar les variants c.1528C>T (p.R510C) i c.1682G>A (p.R561Q) del gen SLC28A1 (hCNT1). L’anàlisi funcional d’aquestes variants va mostrar que afecten l’estructura tridimensional d’hCNT1, alteren el patró de glicosilació i disminueixen la vida mitjana dels mutants, comprometent l’activitat d’hCNT1. La co-transfecció d’ambdues variants, emulant la disposició al·lèlica trans del pacient, va mostrar disminució de l’activitat d’hCNT1. Un anàlisi posterior va identificar dues variants patogèniques del gen PRF1, indicant que el pacient també tenia Limfohistiocitosi Hemofagocítica Familiar tipus 2. Per tant, el pacient presentava un fenotip agreujat per la co-existència de dos defectes monogènics.
En paral·lel, s’ha identificat l’E3 lligasa RNF41 com a proteïna d’interacció d’hCNT1, i s’ha vist que està involucrada amb l’activitat del transportador.
Per altra banda, la pèrdua d’expressió dels hCNTs en càncer va propiciar l’estudi dels mecanismes de regulació dels gens corresponents. Així, es va determinar que l’estat de l’epigenoma condicionava l’expressió dels transportador, concretament l’acetilació de les histones. Es va tractar un panell de línies cel·lulars tumorals amb SAHA, un inhibidor d’histona desacetilases, i es va detectar increment de l’expressió dels transportadors hCNT1 i hCNT2 a temps curts que es traduïa en un augment d’activitat dependent dels hCNTs.
Per estudiar els elements que podrien regular l’expressió d’hCNT1 es va clonar la regió promotora del gen SLC28A1, l’activitat del qual depèn del context cel·lular. La regió amb major activitat promotora corresponia a un fragment de 400pb situat 1695pb downstream respecte l’inici de transcripció (TSS). Es van identificar els factors de transcripció STAT3, YY1, KLF6, p53 i E2F1 com a candidats a la regulació d’SLC28A1. Es va detectar que l’estat de p53 condicionava l’activitat del promotor d’SLC28A1. L’expressió heteròloga de KLF6 produïa una tendència d’increment d’expressió d’hCNT1 a nivell d’mRNA i cert augment del transport concentratiu. Es va identificar que KLF6 s’unia al promotor d’SLC28A1 a -470pb respecte el TSS.
Per últim, s’ha relacionat l’eix CDK4-pRb-E2F1 amb l’expressió dels transportadors de nucleòsids. La inhibició de CDK4 amb abemaciclib produïa un augment d’expressió a nivell d’mRNA dels transportadors concentratius a temps curts, mentre que l’expressió d’hENT1 disminuïa. Per hCNT1 i hENT1 aquests canvis eren efectuats per E2F1, el qual s’ha demostrat que s’uneix al promotor d’SLC28A1 i SLC29A1. En silenciar E2F1, l’expressió d’hCNT1 i hENT1 augmentava, mentre que en sobreexpressar-lo, l’expressió d’hCNT1 era disminuïda. Per tant, E2F1 podria estar contribuint a la regulació de l’expressió coordinada dels transportadors hCNT1 i hENT1.
