Clonaje de enzimas termoestables de interés biotecnológico y desarrollo de herramientas para su expresión en Thermus thermophilus

• Autores: Renata Moreno Albiger
• Directores de la Tesis: José Berenguer Carlos (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2004
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Antonio Ventosa Ucero (presid.), Irma Marín Palma (secret.), Miguel Angel de Pedro Montalban (voc.), Eduardo Díaz Fernández (voc.), Iñigo Lasa Uzcudun (voc.)
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• Resumen

  • En este trabajo se describe la construcción de vectores bifuncionales E.coli-Thermus, en los cuales la trascripción se encuentra bajo el control de la región promotora (Pnar) del operón de una nitrato reductasa respiratoria de Thermus thermophilus HB8 siendo inducido mediante la adición de nitrato a cultivos anóxicos o microaerofílicos. Las excelentes propiedades de este promotor se demuestran a nivel de RNA expresando desde un vector doble, una ribozima SMalfa1 termoestable procedente de Schistosoma mansoni y, en orientación opuesta, y desde el promotor constitutivo de la proteína SlpA su RNA diana.

    Gracias a este sistema se ha podido ver por vez primera la actividad de una ribozima "in vivo" en un microorganismo termófilo y determinar la temperatura optima de actividad de la misma. Basados también en este promotor, se han creado un par de vectores para la producción de proteínas en Thermus tanto en forma nativa, como unidas a secuencias de polihistidinas en amino o carboxilo.

    Para su análisis hemos empleado por primera vez en termófilos dos genes testigo que codifican respectivamente una beta-galactosidasa citoplásmica procedente de una cepa de Thermus sp; y una fosfatasa hiperalcalina periplásmica que hemos clonado a partir de una genoteca de T.thermophilus y caracterizado.

    Como ejemplos de aplicación de estos vectores, se muestran datos de expresión de Thermus sp como la DNA polimerasa A cuya purificación apartir de Thermus le confiere ventajas en determinados ensayos clínicos, SlrA, una proteína periplásmica muy tóxica en E.coli, y de dos catalasas de manganeso que no dan lugar a formas activas en las sobreexpresiones en E.coli. Como ejemplo de expresiones de genes procedentes de mesófilos y pensando en su futura termoestabilización por selección funcional en Thermus, hemos expresado un GFP (proteína verde fluorescente) procedente de la medusa Aequorea victoria y la xilanasa Xhis1 procedente de Streptomyce