La funció de cerkl a la retina: generació d´un model de ratolí i anàlisi de la seva implicació en la resposta a estrès oxidatiu
- Autores: Elena Domènech Borrego
- Directores de la Tesis: Gemma Marfany i Nadal (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2021
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Susana Balcells Comas (presid.), Alejandro Garanto Iglesias (secret.), Miquel Tuson Segarra (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Genética por la Universidad de Barcelona
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
La Retinitis Pigmentosa (RP) es una distrofia degenerativa de la retina (IRD) de carácter hereditario y mendeliano que afecta a 1:4.000 individuos alrededor del mundo. De entre las IRDs, la RP es la causa más común de ceguera y, actualmente, existen más de 90 genes causativos de RP. Entre estos genes se encuentra CERKL, asociado a RP y distrofia de conos y bastones de herencia autosómica recesiva, aunque la función molecular del gen no está aún determinada.
Durante esta Tesis, se ha generado un modelo animal murino mediante la edición génica por CRISPR/Cas9, delecionando el locus de Cerkl. Desafortunadamente, el homocigoto knockout de este modelo es letal, por este motivo generamos un doble heterocigoto con un modelo existente previamente knockdown, dando lugar al modelo CerklKD/KO, que presenta menos de un 10% de expresión del gen en la retina y es totalmente fértil y viable. Durante el envejecimiento, las retinas de los ratones CerklKD/KO muestran un decremento en el número de conos, pérdida de núcleos de los fotorreceptores, elongación de los segmentos externos de los fotorreceptores con deslocalización de las opsinas, alteraciones en los microvilli del RPE y la fagocitosis, y un incremento en la expresión de GFAP. Estas alteraciones morfológicas causan una disfunción fisiológica de la retina, promoviendo la apoptosis de los fotorreceptores. Remarcablemente, los electroretinogramas iniciales realizados en animales jóvenes (6 meses) no muestran diferencias significativas entre mutantes y controles, pero en animales viejos (18 meses), estas alteraciones en la respuesta electrofisiológica son muy aparentes. En conjunto, nuestro modelo presenta una degeneración lenta y progresiva de la retina, iniciada con la degeneración de los conos, muy similar al fenotipo de distrófica de conos y bastones (CRD) en humanos.
Estudios previos sugerían que CERKL podría estar implicado en la respuesta al estrés. Gracias a la generación de este modelo, hemos podido realizar estudios de estrés lumínico en retinas de ratones albinos, y estudios de estrés oxidativo (OS) en cultivos primarios de células ganglionares (RGCs). Ambos ensayos revelan que, frente a un estímulo de estrés, CERKL responde formado parte de gránulos de estrés (SGs) e incrementando su producción, siendo este incremento y desplazamiento hacia los SGs mucho más exagerado en las retinas CerklKD/KO. Además, en células en cultivo se ha demostrado que CERKL es una proteína dinámica y que, en condiciones de OS, se desplaza hacia el núcleo. Además, se generaron copas ópticas de retina derivadas de hiPSCs obtenidas a partir de un paciente afecto de RP y portador de la mutación p. R283* en homocigosis, y de su hermana sana, como control. Estudios de respuesta al OS muestran que las copas ópticas que provienen del paciente presentan de manera basal SGs, y responden frente a un estímulo de OS incrementando la expresión de CERKL, que se localiza en los SGs de forma más exacerbada que en el control. Estos resultados son totalmente concordantes con los obtenidos con retinas del modelo CerklKD/KO. Por tanto, estos estudios demuestran que CERKL es una proteína de respuesta al OS con un papel esencial para abordar el estrés cotidiano de la luz solar y el estrés metabólico, entre otros, y que mutaciones en este gen disminuirían la resiliencia de las células retinales al OS.
Finalmente, se ha realizado una prueba de concepto mediante nanopartículas (NPs) de oro como potencial vector de entrega de DNA en ensayos de rescate fenotípico o terapia génica. Los resultados de estos experimentos demuestran que las NPs cargadas con DNA (DNA-NPs) son capaces de entrar en las células ARPE-19 y expresar el gen reportero, además esta internalización se da en cierta medida por vías alternativas independientes de clatrina. Complementariamente se han realizado pruebas de internalización en explantes de retina demostrando que son capaces de penetrar dentro del tejido y expresar el gen reportero con éxito, además de entrar prefencialmente en los conos.
