Resumen de Papel de la impronta genómica y su regulación epigenética en células madre neurales: relación con la formación de tumores
INTRODUCCIÓN Del zigoto a la célula madre adulta La formación de un organismo se inicia con la aparición del zigoto, una célula totipotente capaz de formar el resto de estructuras embrionarias y extraembrionarias (Sobhani et al., 2017). Este potencial de diferenciación se va perdiendo durante el desarrollo, de manera que en el estadío de blastocisto, las células de la masa interna (ICM) son capaces de formar células de las tres capas germinales, pero no de las extraembrionarias, pasando a ser células pluripotentes. En el organismo adulto, esta capacidad pluripotente desaparece; sin embargo, existen poblaciones discretas de células situadas en los diferentes tejidos con capacidad de auto-renovación y diferenciación hacia un determinado linaje o multipotentes, llamadas células madre adultas. Estas células son esenciales para mantener la homeostasis del tejido mediante el aporte celular o la reparación en caso de daño (Cheung and Rando, 2013; Wagers and Weissman, 2004).
Células madre neurales y neurogénesis adulta Las células madre adultas situadas en el cerebro son conocidas como células madre neurales (NSCs) y suponen un reservorio de células multipotentes responsables de la formación de nuevas neuronas a lo largo de la vida del organismo, proceso conocido como neurogénesis (Kempermann et al., 2015). Este complejo y estrechamente regulado proceso queda restringido a dos regiones cerebrales en los mamíferos adultos, la zona subventricular (SVZ) en la pared lateral de los ventrículos, y la zona subgranular (SGZ) en el giro dentado del hipocampo (Kempermann et al., 2015; Lim and Alvarez-Buylla, 2014). La SVZ, el nicho neurogénico más activo en los roedores, y contiene célula madre llamadas células B1, que al activarse, generan células progenitoras de amplificación rápida o células tipo C, que a su vez, producen células tipo A o neuroblastos, que migran a través de la vía rostral migratoria (RMS) hasta alcanzar los bulbos olfativos (OBs) donde se integran y diferencian en interneuronas (Giachino et al., 2014; Lagace et al., 2007). En la SGZ, las células madre conocidas como células radiales o tipo I, forman progenitores de tipo II, que a su vez, generan neuroblastos o células tipo III. Estos neuroblastos migran a la capa granular del giro dentado y se diferencian en células granulares, que se integran en los circuitos neuronales (Ghosh, 2019; van Praag et al., 2002). Debido a la falta de marcadores definitorios de las células madre neurales, los principales conocimientos sobre estas células han sido posibles gracias a su cultivo in vitro (Ming and Song, 2011). Sin embargo, en los últimos años, se han desarrollado estrategias de detección y aislamiento de estas células gracias a la identificación de combinaciones de marcadores presentes en las diferentes subpoblaciones celulares mediante citometría de flujo (Belenguer et al., 2020; Llorens-Bobadilla et al., 2015).
Regulación epigenética de la neurogénesis adulta La neurogénesis adulta en ambos nichos es un proceso dinámico que se encuentra altamente regulado por factores intrínsecos y extrínsecos (Gage, 2000; Lim and Alvarez-Buylla, 2016). Los mecanismos epigenéticos que regulan la actividad de las NSCs implican modificaciones que afectan a la expresión génica sin alterar la secuencia de nucleótidos (Bird, 2007; Jaenisch and Bird, 2003). La metilación del DNA se trata de uno de los mecanismos más comunes de regulación de la expresión génica e implica la actividad de enzimas que incorporan el grupo metilo, las DNA metiltransferasas (DNMTs), y enzimas encargadas de la desmetilación activa del DNA, las deoxigenasas TET (Ito et al., 2011). Precisamente la enzima TET3 es el único miembro de la familia que mantiene sus niveles de expresión en el organismo adulto, y su función ha demostrado ser clave en la regulación de las NSCs adultas (Montalban-Loro et al., 2019). La metilación del DNA participa de forma esencial en multitud de procesos tanto fisiológicos como patológicos.
Impronta genómica y regulación de la dosis génica La impronta genómica es el mecanismo epigenético responsable de la expresión monoalélica de algunos genes, los genes improntados (Ferguson-Smith, 2011; Ishida and Moore, 2013). Este proceso es regulado por metilación en regiones concretas del DNA llamadas región de control de impronta (ICR) donde se sitúan las regiones diferencialmente metiladas (DMRs) del alelo materno y paterno, y que permite regular de forma conjunta diversos genes improntados debido a que éstos se encuentran generalmente agrupados en “clusters” (Abramowitz and Bartolomei, 2012; Dindot et al., 2009). Las ICRs pueden estar metiladas en el cromosoma heredado maternalmente o metiladas en el cromosoma paterno, definiendo el patrón de expresión de los alelos improntados. La deleción de estas regiones reguladoras conlleva la pérdida de impronta genómica (LOI) en los genes situados en el “cluster”, y está asociada a diversos síndromes de impronta como el síndrome de Prader-Willis o de Angelman, o también al cáncer; la mayor parte de ellos afectando al desarrollo y al sistema nervioso central debido a la implicación de estos genes en el desarrollo del embrión y en el cerebro adulto (Cleaton et al., 2014; Eggermann et al., 2015; Ishida and Moore, 2013).
La impronta genómica es establecida en los gametos y debe ser mantenida durante el desarrollo del organismo para asegurar las marcas epigenéticas que determinan el origen parental de cada alelo (Li and Sasaki, 2011). Sin embargo, este proceso puede ser selectivamente “apagado” de forma no patológica en ciertos tipos celulares y/o momentos concretos del desarrolla para permitir la expresión del alelo silenciado (Ferron et al., 2011; Ferron et al., 2015). Este fino y llamativo mecanismo de regulación de la dosis génica ha sido observado precisamente en las NSCs adultas, en las que la expresión del gen improntado de expresión paterna Dlk1, presenta expresión bialélica en las NSCs postnatales de la SVZ, siendo clave para el correcto funcionamiento del proceso de neurogénesis (Ferron et al., 2011). También el factor de nicho IGF2 se expresa de forma bialélica en los plexos coroideos, vasculatura y meninges, siendo necesario para la homeostasis de las NSCs de la SVZ; mientras que las NSCs procedentes de la SGZ mantienen de forma improntada el gen de expresión paterna Igf2 (Ferron et al., 2015). Estos ejemplos, muestran como la expresión de los genes improntados es específica y clave en el mantenimiento de las NSCs adultas.
Reprogramación celular y adquisición de un estado pluripotente Las células adultas especializadas pueden ser reprogramadas a un estado previo indiferenciado equivalente a las células de la masa interna del blastocito, las célula madre pluripotentes inducidas (iPSCs), adquiriendo las capacidades de auto-renovación y potencial de diferenciación, características de las células madre (Takahashi and Yamanaka, 2006, 2016). La adquisición del estado pluripotente implica cambios de expresión génica, aumentando aquellos genes relacionados con el proceso de indiferenciación, y disminuyendo los genes específicos del linaje de la célula somática; así como alteraciones epigenéticas incluyendo la reactivación del cromosoma X inactivo en las células procedentes de hembras, hipometilación del DNA o silenciamiento de los genes exógenos (Teshigawara et al., 2017). Además, el proceso de reprogramación inducida a iPSCs se caracteriza por eventos variables de pérdida de impronta (LOI), considerándose por algunos autores como un marcador de pluripotencia (Li et al., 2019; Takikawa et al., 2013). En concreto, el locus paternalmente metilado Dlk1-Dio3, regulado por los niveles de metilación en IG-DMR, se encuentra frecuentemente alterado en las iPSCs (Li et al., 2019; Li et al., 2011). Curiosamente, las DMRs metiladas paternalmente parecen estar más afectadas por la pérdida de impronta que las metiladas maternalmente (Bar et al., 2017; Rugg-Gunn et al., 2007).
La inducción de la reprogramación celular se ha llevado a cabo mediante diferentes mecanismos, tanto virales como no virales capaces de integrarse en el genoma o mantenidos de forma transitoria. Los organismos transgénicos portadores del casete OSKM que codifica para los cuatro factores transcripcionales Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc, es una de la estrategias más utilizadas y que ha permitido el estudio del proceso de reprogramación en el animal vivo (Abad et al., 2013; Ohnishi et al., 2014; Rodriguez-Matellan et al., 2020).
Cáncer cerebral: teoría de la célula madre cancerosa El estudio sobre el origen del cáncer continúa siendo un aspecto prioritario en la investigación de esta patología. Se han descrito en numerosos tipos de cáncer la presencia de células con características de célula madre llamadas células madre cancerosas (CSCs), responsables de la formación y el mantenimiento del cáncer, así como la resistencia a tratamientos (Ayob and Ramasamy, 2018; Fabian et al., 2013; Reya et al., 2001). Debido a la multitud de características compartidas entre las células madre de tejido y estas células patológicas, diversos estudios han situado el origen de las CSCs en la transformación maligna de las células madre de tejido.
Cáncer en cerebro En el cerebro humano existen diferentes tipos de tumores que difieren en el origen celular y la parte del cerebro afectada, siendo el glioblastoma (GBM) el tumor primario cerebral más común y agresivo (Claus et al., 2005). Se han descrito numerosas alteraciones genéticas y epigenéticas implicadas en el GBM. Una de las alteraciones más comúnmente encontradas en los pacientes de GBM es la amplificación de la molécula EGFR, un activador de diversas vías de señalización que incluyen proliferación, supervivencia, migración y tumorigénesis. Por ello, está alteración ha sido asociada al GBM de tipo clásico. Los glioblastomas presentan una alta heterogeneidad, ejemplo de ello es la presencia de diferentes subtipos dentro del GBM. Mientras que el subtipo clásico se caracteriza por el aumento de EGFR, un aumento de la molécula OLIG2 se asocia a un fenotipo pro-neural y menos agresivo. El subtipo más agresivo es el de tipo mesenquimal, el cual contiene elevados niveles de CD44. Sin embargo, estas moléculas, junto con otros marcadores asociados al GBM, no son exclusivas de estas células patológicas sino que también están presentes en las NSCs. Hecho que refuerza la idea de la NSC como célula de origen del GBM. Si bien, diversos genes han sido relacionados con esta patología, las alteraciones en los niveles de metilación de los promotores es la principal marca epigenética que sucede durante la transformación maligna. Precisamente, las muestras de pacientes de GBM muestran una disminución en los niveles de la marca epigenética 5hmC, coincidente con una disminución de la enzima TET3, implicada en la conversión del grupo 5mC en 5hmC. El aumento de esta enzima ha demostrado inhibir la proliferación de las células de GBM (Cui et al., 2019).
Los genes improntados son susceptibles a las mutaciones que pueden ocasionar la formación de tumores debido a su expresión monoalélica y a su implicación en la regulación del crecimiento y el metabolismo. Los pacientes afectados por síndromes de impronta genómica presentan una mayor susceptibilidad a desarrollar tumores, revelando la implicación de este mecanismo epigenético en el cáncer. Precisamente, la pérdida de impronta genómica es uno de los eventos más comunes y tempranos en esta patología, siendo la LOI en el locus IGF2-H19 en el tumor de Wilms la asociación entre impronta y cáncer mejor caracterizada; si bien, alteraciones en diversos genes improntados han sido descritas (Leick et al., 2012; Uribe-Lewis et al., 2011). Con el fin de estudiar los distintos factores implicados en el origen y mantenimiento del GBM, se han desarrollado diferentes estrategias (Sampetrean and Saya, 2018). Sin embargo, resulta complicado generar modelo que formen estos tumores de forma eficiente, por ello, diversas mutaciones suelen ser requeridas. Una de las estrategias más utilizadas es el uso de xenotrasplantes o alotrasplantes. Sin embargo, esta metodología no permite abordar uno de los aspectos más interesantes del glioblastoma, su origen.
OBJETIVOS El descubrimiento de células madre cancerosas (CSCs) en los tumores con semejanzas a las células madre de tejido promovieron la teoría de la célula madre cancerosa, que defiende que la transformación maligna ocurriría en estas célula madre de tejido a través de alteraciones genéticas y/o epigenéticas. En el cerebro, entender los mecanismos implicados en el mantenimiento de las NSCs y la relación con la transformación maligna es clave para el desarrollo de herramientas de diagnóstico y tratamiento de los tumores cerebrales. Precisamente, la alteración del mecanismo epigenético de impronta genómica es uno de los eventos más comunes y tempranos en el cáncer. Por ello, el principal objetivo de esta tesis es identificar el papel de la impronta genómica y su regulación epigenética en la actividad de las NSCs adultas, y su implicación en el desarrollo de tumores cerebrales.
Los objetivos específicos propuestos en esta Tesis son: 4. Estudio del proceso de impronta genómica y su regulación epigenética en NSCs adultas de la SVZ.
5. Estudio del proceso de impronta genómica y su regulación epigenética en el glioblastoma.
6. Estudio del papel de la enzima TET3 en la regulación de la impronta genómica durante la transformación maligna.
MATERIAL Y MÉTODOS 1. Animales experimentales Los animales utilizados en esta tesis así como los procedimientos experimentales han sido aprobados por el comité de ética de la Universitat de València. En este trabajo se han utilizado diferentes cepas murinas: i4F (portador del transgen OSKM), GFAP-rtTA (portador del activador transcripcional bajo el promotor de Gfap), C57BL6 (cepa salvaje), CAST/EiJ (cepa salvaje utilizada para la generación de animales híbridos) y la cepa Nude (cepa inmunodeprimida). Los experimentos se llevaron a cabo en animales de entre 2-4 meses de edad generalmente, a excepción de los MEFs obtenidos de embriones E14,5 y la electroporación en animales postnatales (P2).
2. Cultivos celulares Los estudios de reprogramación llevados a cabo en este trabajo se han realizado con animales portadores el activador transcripcional rtTA y del transgén OSKM inducible por doxiciclina (Abad et al., 2013). De estos animales se han utilizado MEFs, obtenidos a partir de la disgregación con tripsina/EDTA de embriones de E14,5. En el caso de la obtención de NSCs adultas reprogramables procedentes de la SVZ, la disección y el cultivo se hicieron mediante aislamiento de la SVZ y posterior disgregación con papaína. Las células fueron sembradas para permitir el crecimiento en forma de neuroesferas y disgregadas nuevamente con Acutasa® para expandirlas.
Las líneas de glioblastoma (GBM) murino, GBM-EGFR, fueron obtenidas del laboratorio de la Dra. Pilar Sánchez Gómez. Estas líneas fueron generadas a partir de la sobre-expresión de Egfr en NSCs adultas deficientes en p16 y p19 y posterior inyección en ratones inmunocomprometidos. Para su expansión, las células fueron disgregadas con AccumaxTM y cultivadas de nuevo en su medio correspondiente.
3. Reprogramación in vitro mediante el tratamiento con doxiciclina La reprogramación de los MEFs de ratones portadores del transgen OSKM se basó en el tratamiento con 1 µg/ml de doxiciclina en el medio KsR con LIF (Abad et al., 2013). La aparición de células con características pluripotentes, detectadas por la presencia del marcador SSEA1, fue indicativo del proceso de reprogramación. Estas células SSEA1+ fueron aisladas y cultivadas en ausencia de doxiciclina para la reprogramación completa en iPSCs. En cuanto a la reprogramación de las NSCs adultas, los cultivos primarios de NSCs de la SVZ procedente de ratones adultos reprogramables fueron tratados con 1 µg/ml de doxiciclina en el medio de NSCs. Tras la aparición de agregados clonales SSES1+, las células fueron cultivas en medio ES con LIF, en presencia de doxiciclina. Finalmente, las células fueron cultivadas en medio selectivo 2i con LIF, inicialmente en presencia de doxiciclina que finalmente fue retirada para permitir la reprogramación completa a iPSCs. 4. Caracterización de las iPSCs La caracterización de las iPSCs se realizó mediante la detección de marcadores asociados a pluripotencia así como el testado de dicha capacidad. La actividad fosfatasa alcalina se realizó tras la fijación de las células con metanol frío y posterior tinción con fosfato de Naftol, Dimetilformamida y Fast Red Salt en el tampón Tris-HCl. La capacidad de formar cuerpos embrioides se hizo por el método de la gota colgante y de flotación. Ambas estrategias se basaron en el cultivo de las iPSCs a baja densidad en presencia de suero. La reactivación del cromosoma X se realizó mediante el análisis de expresión de los genes Xist y Tsix, implicados en este proceso. También se analizó la expresión de Pgk1, situado en el cromosoma X. Con el fin de comprobar si la reprogramación había dado lugar a aberraciones cromosómicas se realizó un estudio del cariotipo de las iPSCs mediante inhibición de la división celular, posterior choque hipotónico y fijación con Carnoy frío. Los cromosomas se contrastaron con la tinción Giemsa y el número de cromosomas por metafase fue cuantificado.
La diferenciación de las iPSCs a neuroprogenitores (NPs) se basó en la formación de cuerpos embrioides y posterior tratamiento con ácido retinoico (AR) durante 4 días, tras los cuales se analizaron las características neurales de las células.
5. Reprogramación in vivo mediante el tratamiento con doxiciclina La reprogramación in vivo se llevó a cabo utilizando dos modelos basados en la expresión del transgén OSKM; un primer modelo, i4F-B, de reprogramación sistémica debido a la presencia del activador transcripcional rtTA en locus Rosa26, y un segundo modelo, GFAP-rtTA;i4F, de reprogramación específico de cerebro debido a la presencia del rtTA bajo el promotor de Gfap. Para la inducción de la expresión de OSKM, ambos modelos fueron tratados con doxiciclina en agua edulcorada con 7,5% de sacarosa. Sin embargo, el tratamiento en el modelo i4F-B se basó en 2,5 semanas con 0,2 mg/ml de doxiciclina, mientras que los animales GFAP-rtTA;i4F fueron tratados durante 4 semanas con 1 mg/ml.
La obtención de células tumorales de animales GFAP-rtTA;i4F tratados con doxiciclina para inducir la reprogramación in vivo, se realizó mediante la disgregación con tripsina del cerebro de estos animales y posterior cultivo en medio de GBM.
6. Caracterización de las líneas de GBM La sobre-expresión de Tet3 en la línea GBM-EGFR se realizó mediante nucleofección con el sistema piggyBAC transposasa del vector control, el vector Tet3 y el vector Tet3 CDmut con el kit Mouse Neural Stem Cell NucleofectorTM. La posterior selección de las células nucleofectadas se realizó con el tratamiento con blasticidina. Para el análisis de ciclo celular, estas células fueron disgregadas para obtener una suspensión de células individuales que fueron teñidas utilizando BD CycletestTM Plus DNA Kit, permitiendo el análisis de las fases del ciclo celular mediante tinción con yoduro de propidio. Los porcentajes de células en cada fase del ciclo celular fueron determinados mediante citometría de flujo con FACSVerse. La detección de células en fase S del ciclo celular también se realizó mediante incorporación del análogo de timidina EdU (5-etinil-2’-deoxiuridina) y posterior revelado. Para ello, las células adheridas fueron incubadas durante 1 hora en presencia de EdU 10 µM y posteriormente fijadas con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras la fijación, se realizó la permeabilización con 0,5% de Triton® X-100 durante 20 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se llevó a cabo el revelado de la EdU. El porcentaje de células EdU positivas fue estimado a partir del número de células totales.
En el ensayo de formación de tumoresferas, las células fueron disgregadas y sembradas a baja densidad, 2500 células en pocillos p96. El número de tumoresferas formadas fue contado manualmente utilizando un microscopio invertido de contraste de fases.
La capacidad de adhesión de las líneas GBM que sobre-expresan el gen Tet3 fue medida mediante un ensayo in vitro en presencia de fibroblastos modificados para la sobre-expresión de la molécula de adhesión N-Cadherina (L-929). Un total de 1x106 células de células de GBM, disgregadas manualmente, fueron marcadas con el fluoróforo CellTraceTM Oregon GreenTM 488 Carboxylic Acid Diacetate, Succinimidyl Ester durante 8 minutos en el baño a 37 °C y protegidas de la luz. Tras lo cual, se sembraron un total de 6500 células sobre fibroblastos NC-929. Los co-cultivos de células fueron incubados durante 40 minutos para permitir la adhesión de las células de GBM. Finalmente, se realizó la fijación de las células con PFA al 2% durante 15 minutos a temperatura ambiente y tinción con DAPI. El número de células de GBM adheridas a la monocapa de fibroblastos fue estimado mediante el script “Cell Adhesion” (https://github.com/paucabar/cell_adhesion_assay), implementado como una macroinstrucción de ImageJ disponible a través del lugar de actualización de Fiji “NeuroMol Lab”, obteniéndose el número de células de GBM adheridas por mm2 a la monocapa de fibroblastos NC-929.
El estudio del papel de Tet3 en la capacidad de angiogénesis se realizó mediante el análisis de la proliferación de células endoteliales humanas HUVEC tras el co-cultivo con células de GBM. Para ello, se sembraron 10.000 células GBMcontrol, GMBTet3 y GBMTet3 CDmut sobre transwells semipermeables. Tras 48 horas de condicionamiento del medio, se realizó un pulso de EdU durante 1 hora sobre las HUVEC. Posteriormente, las células de GBM fueron retiradas y las HUVEC fueron fijadas con PFA 2% durante 15 minutos a temperatura ambiente. También se detectó la molécula Ki67.
7. Estudio de la capacidad de formación de tumores El estudio de la capacidad tumoral de las células, se realizó una inyección de 1,5x106 células/200 µl de iPSCs o 2x106 células/200 µl de GBM y células GFAP-rtTA;i4F en ratones Nude. Las células fueron resuspendidas en PBS suplementado con 30% de Matrigel y se inyectaron subcutáneamente en el área dorso-lateral de la región caudal a cada lado del animal. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño de entre 1,5-2 cm, los animales fueron sacrificados y los tumores fueron extraídos para su análisis. La tinción y detección de marcadores moleculares en cortes de 10 µm de grosor de tumores se hizo mediante la inclusión en parafina y micrótomo de parafina tras haber sido fijados con Carnoy. Para la tinción, se realizó la coloración con Hematoxilina férrica o de Gill durante 9-10 minutos y eosina durante otros 9-10 minutos.
8. Detección in situ de proteínas La detección de proteínas mediante inmunohistoquímica (IHC) e inmunocitoquímica (ICC) se basó en la incubación con una solución de bloqueo compuesta por 0,2% de Triton-100, 1% de glicina, y 10% suero en PBS de muestras fijadas durante una hora en agitación y a temperatura ambiente. A continuación, las muestras fueron incubadas con los anticuerpos primarios durante toda la noche a 4 °C y en agitación. Al día siguiente, las muestras fueron lavadas e incubadas con el anticuerpo secundario durante 1 hora en agitación y a temperatura ambiente. Finalmente, se añadió DAPI para contrateñir los núcleos.
Para la detección de marcadores de membrana por citometría de flujo, las células fueron resuspendidas en 100 µl del tampón de bloqueo de citometría de flujo que contenía los anticuerpos primarios conjugados con fluoróforos. La incubación con dichos anticuerpos se realizó a 4 °C durante 30 minutos, tras lo cual, las células se lavaron y se le añadió DAPI para la exclusión de las células muertas en el análisis. Dicho análisis se realizó utilizando un citómetro LSR-Fortessa.
9. Extracción de RNA y análisis de expresión génica La extracción de RNA en tejidos y en cultivos celulares fue realizada mediante el Kit RNeasy Mini incluyendo una digestión de DNA mediante la enzima DNAsa. El RNA fue cuantificado mediante un espectrofotómetro y se realizó la retrotranscripción de 1 µg de RNA en DNA complementario (cDNA) usando RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit. El análisis de expresión génica fue llevado a cabo mediante PCR a tiempo real, usando 4 ng del cDNA y sondas TaqManTM específicas para cada gen o sondas SYBR-green. Los niveles de expresión de cada gen fueron obtenidos mediante cuantificación relativa (ΔCt) usando la expresión de los genes Gapdh y 18S como controles endógenos. En el caso de las sondas SYBR-green se realizó curva estándar con diluciones seriadas a partir de una mezcla de cDNA generada a partir de cada muestra.
10. Estudio del estado de impronta genómico Las secuencias de DNA de los genes improntados de interés fueron obtenidas de la base de datos NCBI Web Site. Para la identificación de los SNPs entre las subespecies se diseñaron cebadores para la amplificación de la región de cDNA de interés en cerebro de ratones C57/BL6 y ratones CAST/EiJ de dos meses de edad. Para determinar la expresión alelo-específica de los genes improntados se amplificaron las regiones que contenían el SNP para el gen estudiado mediante PCR utilizando sondas específicas a partir de cDNA de animales híbridos. Posteriormente se procedió a la secuenciación de los productos de PCR purificados.
11. Estudio de la metilación del DNA en regiones de control de impronta La obtención de DNA fue realizada mediante solución de extracción a 55°C durante toda la noche. A continuación, se añadió 1 ml de fenol a pH 8 y las muestras fueron agitadas durante 15-30 minutos y posteriormente centrifugadas a 13.000 rpm durante 30 minutos. Se añadió 1 ml de fenol:cloroformo (1:1) equilibrado a la fase acuosa. Se agitaron y centrifugaron de nuevo, y la fase acuosa se transfirió a nuevos tubos y se añadió 1 ml de cloroformo. Finalmente, se añadió 200 µl de NH4CH3CO2 a 10M. Las muestras fueron agitadas suavemente y se les añadió 2 ml de etanol absoluto. Se dejaron en agitación durante toda la noche a 4 °C. Los pellets de DNA se incubaron con etanol al 70%, invirtiendo el tubo varias veces y se centrifugaron. Se añadieron 200 µl de agua inmediatamente después y se incubó a 55°C durante 1 hora.
El análisis de los niveles de metilación en las DMR de las ICRs se hizo mediante pirosecuenciación. Para ello, previamente se llevó a cabo la conversión bisulfítica del DNA, tras lo cual, se amplificó por PCR la región de interés. La determinación del porcentaje de metilación en locus específicos fue calculado como 2-ΔΔCt x 100%, donde ΔΔCt = (CTTarget – CTReference)muestra – (CTTarget – CTReference)DNA completamente metilado.
RESULTADOS 1. La reprogramación de NSCs a iPSCs in vitro se asocia con cambios en la expresión y el estado epigenético de genes improntados La reprogramación de NSCs adultas portadoras del transgén OSKM inducible por doxiciclina se inició en ausencia de LIF, apareciendo células SSEA1 positivas, pre-iPSCs, que terminaron de reprogramarse eficientemente en el medio selectivo 2i/LIF en ausencia de doxiciclina tras 20-30 días desde el inicio del tratamiento. La adquisición del estado pluripotente fue comprobada con el aumento de la expresión de los genes Oct4, Nanog y Rex1, una disminución de genes neurales, y el silenciamiento del transgén. También mediante la capacidad de formación de células de las tres capas germinales in vitro e in vivo. Además, las iPSCs, que no sufrieron aberraciones cromosómicas, sí reactivaron el cromosoma X silenciado en las células procedentes de animales hembra. Estas iPSCs además, eran capaces de diferenciarse nuevamente al fenotipo neural al ser cultivadas en medio con suero y ácido retinoico.
La reprogramación celular a un estado indiferenciado pluripotente también mostró cambios en la impronta genómica. El análisis de expresión de los genes improntados en las iPSCs mostró un elevado porcentaje (84,62%) de genes alterados con respecto a las NSCs de origen, de los cuales alrededor del 40% revirtieron al ser diferenciadas nuevamente a neuroprogenitores (NPs). Al analizar la relación de los niveles de metilación en las DMRs en ICRs, se observó una hipometilación generalizada en las iPSCs que únicamente revertía en los NPs de las gDMRs paternalmente metiladas. Sin embargo, la mayor parte de alteraciones en la expresión de los genes improntados no era explicable con los cambios en los niveles de metilación. Únicamente los genes Ins2 y Dlk1, mostraron cambios en la expresión y metilación coincidentes tanto en iPSCs como en NPs. Dlk1 es un gen improntado de expresión paterna que pierde dicho estado de impronta en las NSCs postnatales de forma fisiológica. Precisamente, la reprogramación de las NSCs dio lugar a la adquisición del estado de impronta que volvió a perderse al diferenciar las iPSCs en NPs.
2. El proceso de impronta genómica sufre alteraciones durante la reprogramación y formación de tumores in vivo El análisis de la expresión de muestras de GBM de pacientes con respecto a tejido no tumoral, mostró más del 70% de genes improntados afectados, la mayor parte de ellos, con una disminución en su expresión. Además, el perfil de expresión de los genes improntados mostró ser suficiente para identificar las células de GBM con respecto a tipos celulares no tumorales como los oligodendrocitos e incluso, entre subtipos celulares dentro del propi GBM. Sin embargo, no era capaz de agrupar de forma diferente estas poblaciones tumorales con respecto a las NSCs adultas, indicando un perfil génico común entre ambas poblaciones.
Para estudiar el papel de la impronta genómica durante la adquisición del fenotipo canceroso en cerebro, se utilizó un modelo de formación de tumores basado en la reprogramación de las células. En primer lugar, se llevó a cabo dicha reprogramación con el modelo anteriormente utilizado i4F-B; sin embargo, no resultó ser eficiente para la formación de tumores en cerebro. Por ello, el modelo utilizado en este estudio se basó en la reprogramación de las células GFAP positivas (NSCs y astrocitos). Esto permitió generar tumores cerebrales en el 100% de los animales con marcadores asociados al GBM como CD44, SSEA1 o Nestina, entre otros. Estos tumores mostraron alteraciones en gran parte de los genes improntados analizados.
Con el fin de comparar las alteraciones en la expresión de genes improntados detectadas en los tumores de animales reprogramados con aquellas que ocurren en el GBM, se utilizó un modelo celular murino de GBM basado en la sobre-expresión de Egfr en NSCs adultas de la SVZ deficientes en p16 y p19 (GBM-EGFR). Esta línea celular también presentó alteraciones en la expresión del 50% de los genes improntados, de los cuales, únicamente Peg3 y Snrpn, coincidieron con los cambios en metilación en sus DMRs reguladoras.
3. Estudio del papel de la enzima TET3 en la regulación de la impronta genómica durante la transformación maligna Las enzimas de la familia TET están implicadas en la desmetilación activa del DNA a través de la oxidación del grupo 5-metilcitosina (5mC) en 5-hidroximetilcitosina (5hmC), por lo que podrían estar implicadas en las alteraciones en la impronta genómica observadas en el GBM. Precisamente, la expresión de TET3 disminuye tanto en pacientes de GBM como en la línea murina GMB-EGFR. Por ello, el papel de esta enzima en la regulación de los niveles de metilación en ICRs y la expresión de los genes improntados en GBM fue analizada. La sobre-expresión de esta enzima redujo la proliferación de las células GBM-EGFR, inhibiendo su capacidad de formar tumores in vivo de manera dependiente de la actividad dioxigenasa. Además, este aumento de expresión de Tet3 conllevó a la alteración de más del 50% de los genes improntados, de los cuales Zdbf2, Igf2 y Meg3 mostraron ser dependientes de procesos de metilación. Sin embargo, únicamente los cambios de expresión de Igf2 coincidieron con los cambios en metilación de la DMR reguladora.
CONCLUSIONES 1. La expresión de los genes improntados se encuentra significativamente alterada en el proceso de adquisición del estado pluripotente a partir de NSCs adultas, sugiriendo un papel relevante de la impronta genómica en la reprogramación celular.
2. La reprogramación de adultas NSCs a iPSCs produce la hipometilación global en las regiones de control de impronta, que se revierte durante la diferenciación de las iPSCs en NPs únicamente en las gDMRs paternalmente metiladas. Esto muestra mecanismos divergentes entre la regulación de las DMRs metiladas maternalmente y paternalmente durante la reprogramación.
3. El estado de impronta de Dlk1, que se encuentra perdido en las NSCs adultas, se recupera en las iPSCs y vuelve a perderse tras la diferenciación a NPs, mostrando ser un mecanismo plástico en la regulación de las NSCs adultas.
4. La reprogramación celular in vivo mediante inducción del transgén OSKM en células cerebro del linaje astrocitario es capaz de generar tumores cerebrales, con marcadores asociados a teratoma o GBM.
5. La formación de tumores cerebrales implica cambios en la expresión de diversos genes improntados, mostrando dos perfiles moleculares que podrían coincidir con teratomas o GBM.
6. El GBM humano y murino presenta alteraciones en la expresión de genes improntados, sugiriendo un papel importante de este mecanismo epigenético en el fenotipo canceroso. Dde hecho, el perfil de expresión de genes improntados es suficiente para distinguir poblaciones celulares no tumorales de las células de GBM.
7. El efecto de la expresión de TET3 en humano es controvertido, con niveles altos y bajos asociados con la supervivencia de los pacientes, sugiriendo un papel de la enzima TET3 en la patología.
8. La sobre-expresión de Tet3 en el GBM murino promueve la formación de tumores in vivo de forma dependiente a la desmetilación.
9. TET3 regula la expresión de genes improntados en tumores cerebrales. Esta regulación la ejerce a través de su actividad dioxigenasa en el caso de Zdbf2, Igf2 y Meg3.
