Development of pharmacodynamic biomarkers of the P13K pathway for childhood neuroblastoma

• Autores: Lucas Moreno
• Directores de la Tesis: Andrew Pearson (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2012
• Idioma: inglés
• Tribunal Calificador de la Tesis: Alfredo Carrato Mena (presid.), Manuel Ramírez Orellana (secret.), Vito Pistoia (voc.), Birgit Georerger (voc.), Manuel Hidalgo Medina (voc.)
• Materias:
  • Ciencias médicas
    • Ciencias clínicas
      • Pediatría
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: digitool-uam.greendata.es
• Resumen
  • español

    Introducción: Los biomarcadores farmacodinámicos (PD) se utilizan para demostrar inhibición farmacológica de dianas terapéuticas, así como para evaluar los efectos en las cascadas de señalización intracelular de los nuevos tratamientos contra dianas moleculares. Los biomarcadores farmacodinámicos aceleran el desarrollo de nuevos fármacos y la transición de nuevos fármacos hasta su uso clínico. El neuroblastoma es un tumor infantil de alto riesgo en el que las metástasis de médula ósea son frecuentes. El objetivo de este estudio fue desarrollar biomarcadores farmacodinámicos de la vía de señalización fosfoinositil-trifosfato-kinasa (PI3K)/AKT que puedan ser implementados en ensayos clínicos fase I/II de terapias moleculares, incluyendo: 1) la adaptación de un biomarcador indirecto de la vía de señalización PI3K/AKT en plasma enriquecido con plaquetas (PRP), 2) el desarrollo de la metodología para aislar células tumorales de muestras de aspirado de médula ósea para su uso en biomarcadores proteicos, 3) el desarrollo de un ELISA cuantitativo para medir la expresión de la proteína MYCN en neuroblastoma (un efector de PI3K) y 4) el desarrollo de técnicas para medir la vía de señalización PI3K/AKT directamente en células tumorales aisladas de muestras de medula ósea.

    Material y métodos: Las señales de proteínas total y fosforilada AKT, GSK3 y p70S6K en plasma enriquecido con plaquetas y células tumorales fueron medidas con la tecnología MesoScale Discovery (MSD) ® Triplex AKT. La separación de células tumorales se realizó con métodos de separación inmunomagnética basados en MicroBeads y se desarrollo un ELISA utilizando Europium para cuantificar la expresión de proteína MYCN total. El desarrollo pre-clínico se realizo en células de neuroblastoma provenientes de líneas celulares diluidas en sangre periférica de voluntarios sanos. El desarrollo clínico se realizó en 14 niños con tumores sólidos avanzados, cinco de ellos con neuroblastoma metastásico en la médula ósea. El estudio se realizo con autorización del Comité de Investigación Clínica del Hospital Royal Marsden.

    Resultados: El estudio de los biomarcadores realizados en plasma enriquecido con plaquetas permitió mostrar señales detectables para todas las proteínas totales y fosforiladas en todos los casos. No se encontraron diferencias respecto a edad, diagnostico o estadio. La depleción de células CD45+ fue el método de separación inmunomagnética superior, obteniendo suspensiones celulares con alta pureza en células de neuroblastoma en experimentos con líneas celulares de neuroblastoma en sangre periférica y en muestras de médula ósea de pacientes con afectación metastásica por neuroblastoma. Las suspensiones celulares obtenidas contenían suficiente cantidad de proteína para los biomarcadores requeridos. Se desarrollo un sandwich ELISA basado en Europio para medir la expresión de proteína MYCN total de forma sensible y especifica. Se completo el desarrollo preclínico de la tecnología MSD Triplex AKT para medir la activación de la vía de señalización PI3K/AKT en células de neuroblastoma.

  • English

    Introduction: Pharmacodynamic (PD) biomarkers provide proof-of-principle of target modulation and evaluate downstream biological effects of novel targeted therapeutics. PD biomarkers accelerate drug development and the transition of new drugs into the clinic. Neuroblastoma is a high-risk childhood cancer in which bone marrow metastases are frequent. The aim of this study was to develop PD biomarkers of the phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/AKT pathway to accompany early clinical trials of molecularly targeted agents. This research included: 1) the adaptation of a surrogate biomarker assay of the PI3K/AKT pathway in platelet-rich plasma (PRP), 2) the development of a technique to isolate tumour cells from bone marrow aspirates for PD biomarker assays, 3) the development of a quantitative ELISA to measure MYCN protein expression (a downstream effector of PI3K) and 4) the development of assays to measure the PI3K/AKT pathway in tumour cells isolated from bone marrow samples.

    Material and Methods: MesoScale Discovery (MSD) Triplex AKT assay (total and phospho protein signals for AKT, GSK3 and p70S6K) was used in PRP and tumour cells, tumour cells were isolated using immunomagnetic separation methods based on MicroBeads from the bone marrow. A Europium-based ELISA was developed to quantify MYCN oncoprotein. Pre-clinical testing was performed with neuroblastoma cell lines spiked in healthy volunteer blood samples.

    Clinical testing was performed in 14 children with advanced solid tumours, 5 of them with neuroblastoma metastatic to the bone marrow. The study had Royal Marsden Hospital institutional approval.

    Results: Detectable signal for all total and phospho proteins was found in all cases with the MSD Triplex AKT assay in PRP. No differences according to age, diagnosis or stage were found. CD45 depletion was superior to GD2 positive selection in isolating neuroblastoma cells from bone marrow aspirates and obtained cell suspensions with high purity of neuroblastoma cells in spiking experiments in peripheral blood and in bone marrow samples from children with neuroblastoma metastatic to the bone marrow. Cell suspensions contained sufficient amounts of protein for subsequent analyses. A sensitive and specific Europium-based ELISA was developed to quantify total MYCN oncoprotein levels. The MSD Triplex AKT assay was able to measure PI3K pathway activation in neuroblastoma cells in the bone marrow in a pre- clinical situation.

    Discussion and conclusions: The PRP assay has been validated in the paediatric population and is ready to be implemented in early clinical trials in children as a pharmacodynamic biomarker in the upcoming paediatric first-in-child studies of the dual PI3K/mTOR inhibitors BEZ235 and GDC0980. Immunomagnetic separation with CD45 depletion was found to be an effective technique to obtain pure cell suspensions of neuroblastoma cells as a non-invasive source of tumour cells for protein pharmacodynamic biomarker assays. The pre-clinical development phase of the MYCN ELISA has been completed and this will move to clinical development prior to the Pharmacodynamic biomarkers in neuroblastoma, Lucas Moreno, January 2012 implementation of the clinical trials. The pre-clinical development phase of the MSD PI3K/AKT assay in neuroblastoma cells was completed and this will move to clinical development. The development and implementation of these biomarkers in new biological hypothesis-driven first-inchild phase I clinical trials will lead to better drugs taken forward into phase II/III trials and eventually into clinical practice.