Design, characterization and validation of integrated bioelectronics for cellular studies: from inkjet-printed sensors to organic actuators

• Autores: Dahiana Mojena Medina
• Directores de la Tesis: Pablo Acedo Gallardo (dir. tes.), José L. Jorcano Noval (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Carlos III de Madrid ( España ) en 2021
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: José A. García Souto (presid.), Carlos Elvira Pujalte (secret.), Mary Dimaki Zora (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Ingeniería Eléctrica, Electrónica y Automática por la Universidad Carlos III de Madrid
• Materias:
  • Ciencias tecnológicas
    • Tecnología electrónica
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: e-Archivo
• Resumen

  • Los avances en los últimos años en dispositivos electrónicos diseñados imitando las propiedades de sistemas vivos han logrado acoplar dispositivos electrónicos y órganos/tejidos biológicos con un nivel de integración sin precedentes. Convencionalmente, la forma en que estos sistemas bioelectrónicos son acoplados con órganos o tejidos ha sido a través del contacto superficial entre ambos sistemas, es decir acoplando la electrónica externamente al tejido. Lamentablemente estas aproximaciones no contemplan escenarios donde ha habido una pérdida o daño del tejido con el cual interactuar, como es el caso de daños en la piel debido a quemaduras, úlceras u otras lesiones genéticas o producidas. Una alternativa prometedora para ingeniería de tejidos y medicina regenerativa, y en particular para implantes de piel, es embeber la electrónica dentro del tejido biológico, o presentado de otra manera, cargar el sistema electrónico con células vivas y tejidos fabricados por ingeniería de tejidos como parte innata del propio dispositivo. Este concepto permitiría no solo una monitorización remota y un control basado en señalizaciones eléctricas (sin químicos) de tejidos biológicos fabricados mediante técnicas de bioingeniería desde dentro del propio tejido, sino también la obtención de una “electrónica viva”, biológica y eléctricamente funcional. En este contexto, es un desafío insertar de manera eficiente dispositivos electrónicos con células vivas sin desencadenar reacciones adversas en el sistema biológico receptor ni en el sistema electrónico diseñado. Además, es deseable monitorizar en tiempo real y de manera mínimamente invasiva las respuestas de dichos sistemas biológicos que se han añadido a tales dispositivos bioelectrónicos.

    En este contexto esta tesis doctoral presenta el desarrollo (diseño, fabricación y caracterización) y validación de sensores y actuadores mecánicamente suaves y compatibles con células capaces de funcionar correctamente dentro de un entorno de cultivo celular, específicamente de una línea celular de células epiteliales humanas. Para el desarrollo de los sensores hemos propuesto utilizar técnicas compatibles con la bioimpresión, alejándonos de la micro fabricación convencional explotada en la manufactura de sensores electrónicos, con el objetivo a largo plazo de promover la fabricación de los tejidos y los sensores simultáneamente en un mismo sistema de impresión híbrido. Para el desarrollo de los actuadores hemos explorado el uso de polímeros electroactivos y que son compatibles con impresión y hemos investigado el efecto de estímulos mecánicos dinámicos en respuestas celulares (sin utilizar químicos o medicamentos) con el objetivo a largo plazo de autoinducir y controlar comportamientos biológicos de forma electrónica. En concreto, este trabajo presenta sensores basados en electrodos interdigitados (IDE) impresos por la técnica de fabricación aditiva de inyección de tinta. Validando los sensores se ha investigado el uso de la técnica espectroscopía de impedancia para monitorear la migración celular, proliferación y adhesiones célula-sustrato de una línea celular de células epiteliales humanas (HaCaT) en tiempo real y de manera no invasiva. Por otro lado, este trabajo presenta actuadores biocompatibles basados en el polímero piezoeléctrico fluoruro de poli vinilideno (PVDF) para ser utilizados como sustrato celular y permitir modificaciones de las propiedades mecánicas de dichos sustratos de manera dinámica, en tiempo real y no invasiva. Validando los actuadores se ha investigado los efectos de estimular mecánicamente células HaCaT en la proliferación, migración y morfología celular mediante variaciones dinámicas de la magnitud, frecuencia y duración de los estímulos mecánicos.

    Motivación de la investigación La pérdida de piel y el daño causado por quemaduras graves, úlceras crónicas, cirugías y otros trastornos cutáneos genéticos/adquiridos requieren tratamientos médicos rápidos y proactivos. Como la piel es nuestra principal barrera protectora contra el entorno, las lesiones cutáneas graves pueden ser una fuente importante de infección y pueden dar lugar a múltiples complicaciones, como osteomielitis, edema y sepsis, a menudo asociadas con mortalidad.

    Uno de los pasos esenciales para prevenir la mortalidad y la morbilidad en pacientes que padecen algunas de estas lesiones cutáneas se basa en una escisión temprana de la herida seguida de una cobertura adecuada. Para cubrir y así reparar tales heridas agudas o crónicas se han explorado varios enfoques clínicos, siendo los métodos basados en sustitutos de piel sintética con componentes biológicos, pero no vivos uno de los más utilizados. A pesar de que muchos de estos sustitutos de piel sintética están disponibles comercialmente y permiten restaurar la función de barrera epidérmica y controlar las pérdidas de agua, en escenarios donde hay una pérdida profunda de piel (parcial o total), estos métodos sintéticos carecen de eficacia, dejando a los injertos de piel como la intervención quirúrgica recomendada y a menudo exclusivamente posible. Entre todos los tipos de injerto de piel, el injerto autólogo (piel sana del paciente trasplantada de un área no dañada hacia la región dañada) sigue siendo el estándar de oro actual ya que permite evitar el rechazo inmunológico del paciente. Lamentablemente, para las lesiones cutáneas que involucran una superficie extendida, los sitios sanos del propio paciente de los que extraer un autoinjerto son limitados. Estas limitaciones han llevado a los investigadores a explorar nuevos enfoques para el reemplazo de piel basados en terapias celulares e ingeniería de tejidos.

    Como resultado, se ha logrado un progreso significativo en el desarrollo de sustitutos dermoepidérmicos mediante técnicas de ingeniería de tejidos. En comparación con los apósitos pasivos (sustitutos de piel sintética), las terapias basadas en ingeniería de tejidos han demostrado mejorar los resultados funcionales clínicos en pacientes quemados y son compatibles con la biofabricación tridimensional, incluida la posibilidad de bioimpresión in situ en tiempo real. Sin embargo, uno de los principales problemas que aún permanecen es la capacidad de monitorear dichos sustitutos de piel diseñados tanto en su fabricación como una vez han sido trasplantados. La práctica clínica actual para evaluar tanto la fabricación como el eventual trasplante de dichos injertos de piel de laboratorio se basa en la observación profesional y en pruebas inmunohistoquímicas. Desafortunadamente, estos métodos no solo involucran juicios subjetivos y exámenes por períodos cortos que pueden poner en peligro los estados generales fisiológicos de los pacientes, sino que también conducen a la destrucción de la muestra utilizada para hacer las pruebas inmunohistoquímicos.

    Una solución ante estos problemas ha sido la propuesta de una novedosa tecnología en forma de vendajes inteligentes. En esta tecnología, se integran diferentes tipos de (bio) sensores en un vendaje sintético para monitorear la lesión o el injerto mientras se protege la superficie lesionada. Aunque estos sistemas han sido optimizados para operar en el entorno único de las heridas (es decir, deformables, blandos, húmedos y calientes) y generan datos para la valoración de heridas de manera no invasiva, son incapaces de servir como componentes biológicos naturales para regenerar de forma viable la pérdida de piel. Es decir, no pueden cumplir simultáneamente la doble función de (1) regeneración biológica y (2) monitorización eléctrica de los tejidos dañados. Para facilitar la regeneración biológica, algunos de estos apósitos inteligentes han incorporado tecnología de administración de fármacos (AF). Sin embargo, la mayoría de dichos sistemas de AF son pasivos, lo que significa que las cantidades de liberación y cinética en la liberación de dichos medicamentos es prediseñada y no puede alterarse externamente. La utilización de medicamentos antiinflamatorios, compuestos antibacterianos o antibióticos en momentos y dosis inadecuados pueden dificultar los procesos de cicatrización y pueden conducir al desarrollo de resistencia a los antibióticos.

    Como una alternativa a todos estos problemas mencionados anteriormente, nosotros proponemos la incorporación de equivalentes de piel dermo-epidérmica como parte de dispositivos electrónicos o, al revés, la integración de dispositivos biónicos (sensores y actuadores) como componentes no biológicos dentro de los sustitutos de piel fabricados mediante ingeniería de tejidos. Esta solución propuesta incluiría las múltiples funciones de 1) regenerar biológicamente el tejido perdido y restaurar las funciones órgano-típicas, 2) monitorizar eléctricamente el estado del implante (mediante los sensores) y 3) estimular sin fármacos el tejido modificado cuando sea necesario (mediante los actuadores). Esta innovadora propuesta para el tratamiento de heridas y pérdidas de piel introduciría una nueva tecnología que hemos descrito como sustitutos de piel biónicos vivos e inteligentes.

    Principales resultados alcanzados y discusión Los principales resultados de esta investigación se mencionan a continuación. En relación con los sensores propuestos, este trabajo ha demostrado la posibilidad de fabricar sensores flexibles biocompatibles mediante técnicas de impresión de tinta a temperatura ambiente, sin necesidad de pasos adicionales en salas limpias de fabricación y de bajo coste. Aunque la biocompatibilidad de las nanopartículas de plata (AgNP) es aún un tema de investigación, en este trabajo hemos demostrado que pasivar las líneas conductoras impresas con AgNP utilizando SU-8 genera un sensor completamente biocompatible y electrónicamente funcional. La sensibilidad de los sensores puede verse afectada por esta capa de pasivación, sin embargo, simulaciones descritas en la literatura demuestran que depositar capas delgadas (como es el caso de nuestros sensores) no afecta significativamente las medidas experimentales. El conjunto de electrodos y capa de pasivación de nuestros sensores resultó en una topografía que simula micro- valles de 300 µm en ancho y ~4 µm de altura. Hemos encontrado que esta topografía no plana facilita y promueve las adhesiones celulares en la superficie de los sensores, lo que es altamente conveniente para obtener una alta relación señal-ruido en las medidas. Nuestros sensores flexibles y delgados son biocompatibles y puedes ser integrados con sistemas microfluídicos y lab-on-a-chip.

    En particular, hemos integrado exitosamente nuestros sensores como sustrato de cultivos celulares de la línea celular de células de queratinocitos humanos, HaCaT, y hemos investigado la aplicación de la técnica de microscopía de impedancia para monitorear en tiempo real y de manera no invasiva proliferación y migración celular y las interacciones célula-sensor con los sensores embebidos en el cultivo celular. Hemos encontrado que para utilizar la impedancia como medida de la proliferación celular en primer lugar el número de células inicialmente sembradas y el área que tienen las células para proliferar debe ser conocido: es decir el sistema debe ser calibrado. Estas consideraciones deben ser tenidas en cuenta debido por un lado a la alta dependencia de los comportamientos celulares al tiempo y concentración inicial de células en el cultivo, y por otro lado a la propia naturaleza de inespecificidad en las medidas de impedancia para describir sistemas físicos. Nuestro sistema de igual manera es capaz de detectar confluencia celular de manera no invasiva, en tiempo real y remoto, lo que brinda amplias ventajas en ingeniería de tejidos. Hemos observado que, al utilizar la impedancia para monitorear cultivos celulares, la medida eléctrica puede responder tanto a los cambios en la conductividad del medio de cultivo debido a desechos metabólicos como a las propias propiedades eléctricas de las membranas celulares. Para comprender mejor este problema hemos agregado un detergente iónico (Triton X100 al 0.10 %) en el cultivo celular para aumentar la porosidad de las membranas y con ello alterar sus propiedades eléctricas. Hemos encontrado que el aumento de la porosidad en la membrana celular mediante la adición de Triton X100 (es decir, hiperpermeabilización) se correlaciona con una disminución drástica de la impedancia, lo que nos llevó a atribuir que la principal contribución a la impedancia medida eran las propiedades eléctricas aislantes de las células presentes en la superficie de los sensores. Interrumpir la integridad de las estructuras de la membrana genera cambios en el intercambio célula-medio/célula-célula, así como el camino físico para el paso de la corriente eléctrica, lo que explica esa disminución en la magnitud de la impedancia. También hemos encontrado que la medición de impedancia puede monitorear las adherencias de los queratinocitos al sensor, y hemos demostrado un circuito eléctrico equivalente que describe este proceso de interacciones células-sensor. Creemos que este tipo de medición puede ser relevante para determinar y/o monitorear la adherencia de tejidos y células en sistemas electrónico-implantables.

    Por último, hemos encontrado que la impedancia medida con los sensores propuestos embebidos dentro del cultivo celular es capaza de monitorear la migración celular durante al menos 80 h en un experimento implementado de migración celular. Hemos establecido esta correlación entre la migración celular y la impedancia medida mediante el procesamiento de imágenes microscópicas adquiridas secuencialmente en lapsos de tiempo. Aunque los datos entre el procesamiento de imágenes y las medidas de impedancia han mostrado una muy buena correlación lineal, debemos ser conscientes de que el sistema de detección desarrollado puede carecer de especificidad en la medición de la migración celular sobre otros factores como la densidad celular, la proliferación y la propagación de la señal eléctrica a través de la monocapa celular, factores que han sido demostrados que desempeñan un papel importante durante la migración celular. Aunque estos resultados preliminares son prometedores, llegamos a la conclusión de que para obtener una monitorización completamente eléctrica de los eventos biológicos relacionados con tejidos fabricados por ingeniería de tejidos y en cultivos de células, son deseables sistemas de detección multimodales, es decir mediante arreglo de sensores de diferentes tipos (por ejemplo, de oxígeno, calcio, etc.). En cualquier caso, consideramos que los resultados obtenidos con esta primera generación de sensores de impresión por inyección de tinta y la fabricación, el diseño y las estrategias asociadas representan un paso inicial hacia la unión de la bioimpresión de tejidos de piel sintética con sensores integrados inteligentes.

    En relación con el segundo dispositivo presentado en esta tesis doctoral, los actuadores mecánicos, hemos demostrado la posibilidad de utilizar polímeros piezoeléctricos biocompatibles PVDF como elemento actuador. Hemos encontrado el PVDF como mejor aproximación debido a diferentes ventajas como, por ejemplo, biocompatibilidad, ligereza y la posibilidad tan versátil en su fabricación incluyendo inyección de tinta, lo que refuerza la posibilidad futura de fabricar estos actuadores también utilizando la misma técnica de fabricación de los sensores y de los tejidos biológicos. Explotando este polímero piezoeléctrico, hemos diseñado y fabricado un novedoso sistema electromecánico como herramienta experimental para realizar estimulación mecánica de manera dinámica en cultivos celulares mediante la integración directa del actuador dentro del cultivo celular. Este dispositivo de actuación nos ha permitido realizar experimentos celulares a largo plazo, reconfigurar los parámetros mecánicos del actuador en tiempo real y aplicar fuerzas en el rango de las que aparecen a escalas biológicas (pN), siendo todas estas características que sobresalen como unas de las principales ventajas del sistema propuesto.

    Teniendo en cuenta que la aplicación de fuerzas mecánicas sería una nueva y prometedora forma de controlar el comportamiento celular y, por tanto, de nuevas terapias, hemos estudiado los efectos de variar la magnitud, frecuencia y duración de los estímulos mecánicos (dinámicos) sobre el comportamiento celular en células de queratinocitos HaCaT. Hemos encontrado que estímulos de baja frecuencia (1 Hz), baja magnitud (<0,4 nm) y hasta 6 días potencia la proliferación y migración de esta línea celular de queratinocitos HaCaT con una aparente relación con el alargamiento y organización de la actina. Un estímulo mecánico a frecuencias más altas (80 Hz) ha resultado en un efecto totalmente diferente: las tasas de proliferación y migración celular disminuyeron con un impacto considerable en la morfología celular la cual resultó ser más redondeada y pequeña. En base a estos resultados, hemos concluido que las respuestas celulares de esta línea celular de queratinocitos HaCaT a los estímulos mecánicos aplicados de manera dinámica dependen de la frecuencia. Sin embargo, este resultado preliminar debe ser respaldado por más investigaciones para determinar si este tipo de estimulación mecánica (dirección, magnitud, frecuencia y duración de los estímulos) tiene como resultado un impacto similar en los tejidos de piel diseñados en 3D y, por lo tanto, empujar el campo de dispositivos actuadores flexibles bio-integrados hacia futuras investigaciones más prometedoras.

    Finalmente, y aunque la validación de este actuador ultrafino embebido en los cultivos celulares ha sido demostrada utilizando esta línea celular de queratinocitos, el sistema actuador propuesto es cito-compatible, presenta una fabricación escalable y barata, y es de fácil configuración y manipulación, por lo que entendemos que nuestro dispositivo puede apoyar el estudio de la mecano transducción celular (dinámica) de otros tipos de células (es decir el estudio de las respuestas desencadenas por las células y tejidos biológicos en respuestas a estímulos mecánicos). Debemos resaltar que esta es una característica única y de muy amplia ventaja en nuestro dispositivo electromecánico en comparación con la mayoría de las técnicas de estimulación mecánica actuales utilizadas en el campo de estudio de la mecano-transducción celular. Muy diferente a la reconfiguración en tiempo real de las propiedades mecánicas que ofrece nuestro dispositivo, la mayoría de esos sistemas de estimulación mecánica requieren fabricar y caracterizar nuevos dispositivos desde cero para variar sus propiedades mecánicas (por ejemplo, diseñar y fabricar un nuevo patrón de micro fabricación, sintetizar andamios celulares variando las concentraciones en los compuestos utilizado, etc., incluyendo en todos estos sistemas sus respectivas caracterizaciones). Comprender la mecano-transducción celular no solo es crucial para obtener una visión mucho más profunda de la función de las células, sino que también podría conducir a nuevas tecnologías y aplicaciones clínicas. En este sentido, entendemos que la fabricación, el diseño, las estrategias y los métodos utilizados en el sistema de actuación desarrollado en esta segunda parte de esta tesis doctoral representan un paso inicial hacia los sustitutos de la piel de ingeniería con actuadores integrados inteligentes.

    Ambos sistemas presentados como resultado de esta tesis doctoral contribuyen al desarrollo de tejidos de crecimiento de laboratorio en 3D con electrónica incorporada, promoviendo una investigación hacia la fabricación de sustitutos equivalentes de piel mitad orgánica mitad electrónica como tejidos funcionales biónicos inteligentes.

    Conclusiones En resumen, el objetivo de este trabajo doctoral y su principal contribución ha sido proponer y abrir caminos hacia la investigación de sustitutos de piel bifuncionales inteligentes con electrónica incorporada. Creemos en el potencial de las técnicas de fabricación aditiva, específicamente, la impresión 3D, para guiar una nueva revolución en la bioelectrónica, ya que es la única técnica de fabricación electrónica compatible con la bioimpresión actual. Ninguna otra plataforma como la impresión 3D permite la deposición de una amplia gama de materiales funcionales, desde semiconductores hasta hidrogeles cargados de células, en una gran área de superficies móviles, curvas y tridimensionales sin contacto. Esta capacidad de entrelazar directamente materiales múltiples tridimensionales de estos dos mundos distantes (biología y electrónica) está impulsando la visión de la ingeniería de tejidos cyborg con matrices electrónicas integradas internamente que, en última instancia, se pueden usar a demanda como trasplantes diseñados con funcionalidades aumentadas (biológicas, físicas, electrónicas). Este potencial agregaría una nueva y elegante dimensión a la bioimpresión 3D —una cuarta dimensión— para la capacidad de crear tejidos órgano-típicos inteligentes y transformables. Dicha tecnología puede facilitar el desarrollo de dispositivos bioelectrónicos de próxima generación con un nivel de integración perfecto, lo que eventualmente difuminará las líneas entre los sistemas inteligentes vivientes y artificiales.