La proteïna fosfatasa ppz1 de llevat: estudis estructurals i funcionals en sobreexpressió

• Autores: Carlos Alberto Calafi Pascual
• Directores de la Tesis: Joaquín Ariño Carmona (dir. tes.), Antonio Casamayor Gracia (codir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2020
• Idioma: español
• ISBN: 9788449094651
• Tribunal Calificador de la Tesis: José Ramos Ruiz (presid.), Marc Torrent Burgas (secret.), Francisco Navarro Gomez (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Bioquímica, Biología Molecular y Biomedicina por la Universidad Autónoma de Barcelona
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: TDX
• Resumen

  • Los enzimas Ppz son proteínas fosfatasas que se encuentran solo en hongos y se caracterizan por un dominio catalítico C-terminal muy conservado, parecido al de las fosfatasas PP1c, y una región N-terminal poco conservada. En Saccharomyces cerevisiae, las fosfatasas Ppz están codificadas en los genes parálogos PPZ1 y PPZ2. Ppz1 es la proteína más tóxica en sobreexpresión en levadura, alterando la proliferación celular de manera dependiente de su actividad fosfatasa, aunque los mecanismos que recaen sobre esta toxicidad aún no han sido descubiertos. En este estudio intentamos conocer estos mecanismos. Hemos identificado varios genes que codifican proteínas ribosómicas, así como factores implicados en la biogénesis de ribosomas como supresores en multicopia del efecto tóxico de Ppz1. Esta fosfatasa se une a los ribosomas que empiezan a traducir, y el exceso de Ppz1 produce una caída en la cantidad de polisomas. La ausencia de la quinasa Gcn2 (regulador negativo del inicio de traducción) parcialmente suprime el defecto de crecimiento de una cepa que sobreexpresa Ppz1. Por todo esto, proponemos que parte de los efectos de la sobreexpresión de Ppz1 se deben a la alteración de la síntesis de proteínas.

    A pesar de su dominio catalítico conservado, describimos que Ppz2 no es tóxica cuando se sobreexpresa en las mismas condiciones que Ppz1, aunque los niveles de Ppz2 son menores. Sorprendentemente, una versión híbrida compuesta por el segmento N-terminal de Ppz1 y el dominio catalítico de Ppz2 presentó la misma toxicidad que Ppz1, incluso mostrando niveles de expresión comparables a los de Ppz2. Por tanto, creemos que la extensión N-terminal es importante para la toxicidad de Ppz1.

    También analizamos el nivel de toxicidad de dos versiones de Ppz1: G2A (no miristilable) y R451L (catalíticamente inactiva). El cambio G2A atenuó solo levemente la toxicidad de Ppz1, mientras que la versión R451L eliminó gran parte de la toxicidad. Es sabido que Ppz1 es capaz de inhibir la entrada de K+ vía Trk1. La adición de K+ logró mejorar el crecimiento de las células que portaban las versiones tanto de la Ppz1 nativa como de la versión G2A. Analizamos también el crecimiento de varios mutantes de la vía de respuesta a estrés osmótico (HOG) al sobreexpresar estas versiones de Ppz1. La deleción de HOG1 (que codifica la MAPK central de la vía HOG) redujo visiblemente la toxicidad de las 2 versiones. La ausencia de Nha1, un antiportador Na+,K+/H+, produjo una reducción muy drástica de la toxicidad de la versión G2A. Por último, hipotetizamos un modelo en el que la sobreexpresión de Ppz1 podría alterar el funcionamiento de los transportadores Nha1 y Trk1, explicando el comportamiento de la versión G2A de Ppz1.