Papel de los microarns y la inflamación en la patogénesis de enfermedades autoinmunes
- Autores: Iván Arias de la Rosa
- Directores de la Tesis: Nuria Barbarroja Puerto (dir. tes.), Carlos Pérez Sánchez (codir. tes.), Rosario Lopez Pedrera (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 2020
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Jordi Gratacós Masmitjà (presid.), Justo P. Castaño Fuentes (secret.), José Córdoba Chacón (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: Helvia
- Resumen
1. Introducción.
Los problemas que resuelve el sistema inmunitario de los mamíferos no se limitan a los animales superiores: se enfrentan a todas las formas de vida y ninguno las ignora. La presión que ejerce la selección natural es inagotable e interminable. De tal manera que es de vital importancia comprender cómo maximizar el potencial del sistema inmune al servicio de la salud humana. Es una propiedad fundamental de la inmunidad que ninguna parte de nuestro cuerpo esté aislada de su vigilancia. Por esta razón, aunque el sistema inmune parece algo menos sustancial que un órgano como el corazón o el hígado, en conjunto la inmunidad consume enormes recursos, produciendo una gran cantidad de células de las que depende el cuerpo humano para conseguir un funcionamiento exitoso.
La función principal del sistema inmune es la de proteger al huésped frente a agentes infecciosos. Sin embargo, este sistema es pleiotrópico por lo que bajo ciertas circunstancias podría contribuir al desarrollo de una determinada enfermedad. Entre dichas circunstancias destacan, en primer lugar, los síndromes inmunes deficientes, en los que el sistema inmune es incapaz de responder ante la presencia de patógenos y, en segundo lugar, las enfermedades autoinmunes, en las que ocurre una respuesta inmune exacerbada, reaccionando contra las propias células y tejidos (1, 2).
En primer lugar, el síndrome antifosfolípido (SAF) es una enfermedad autoinmune sistémica caracterizada por la presencia de trombosis arteriales y/o venosas, así como por complicaciones obstétricas (desde pérdidas fetales recurrentes o partos prematuros secundarios hasta insuficiencia placentaria o preeclampsia severa). Se estima que la incidencia de SAF es de alrededor de 5 casos por 100.000 personas al año. Además, está asociado a la presencia persistente de anticuerpos antifosfolípidos (aPLs), incluyendo anticuerpos anticardiolipina (ACA), anti-2 glicoproteína-I (anti-2GPI) y/o anticoagulante lúpico y factores del complemento. Muchos de estos anticuerpos están dirigidos contra proteínas plasmáticas y proteínas expresadas o unidas a la superficie celular de células endoteliales o plaquetas. Los aPLs están presentes en aproximadamente un 13% de los pacientes con accidente cerebrovascular, un 11% con infarto de miocardio, un 9,5% en los pacientes con trombosis venosa profunda y un 6% de pacientes con morbilidad de embarazo (3, 4). Asimismo, se han propuesto diversos mecanismos que podrían explicar la tendencia trombótica existente en los pacientes con SAF, sin embargo, la patogénesis de esta enfermedad parece ser multifactorial.
Por otro lado, la Artritis Reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune de carácter inflamatorio crónico, que se caracteriza por la destrucción progresiva de las articulaciones, afectando en gran medida a manos y pies, causando múltiples deformidades. Además, con frecuencia también pueden presentarse manifestaciones extra-articulares (5). La prevalencia de esta enfermedad está en torno al 1-2% de la población mundial. Asimismo, diversos estudios han mostrado que las mujeres presentan entre 2 y 3 veces más esta enfermedad que los hombres, probablemente debido a la carga hormonal. La enfermedad suele aparecer en edades entre los 50 y 75 años, por lo que, en mujeres mayores de 65, la prevalencia aumenta un 5% (6, 7). Aunque es de etiología desconocida, existen claras evidencias de su naturaleza autoinmune, debido a la presencia de autoanticuerpos como el factor reumatoide (FR, IgM que interacciona con el fragmento Fc de la IgG) o los anticuerpos anti-CCPs (anticuerpos antipéptidos cíclicos citrulinados), también llamados ACPAs (anticuerpos anti-proteínas citrulinadas) (8). El FR no es específico y puede ser hallado en otros desórdenes reumáticos, infecciones o en individuos sanos. Sin embargo, los ACPAs son potentes marcadores serológicos para el diagnóstico temprano de la AR y el pronóstico de la destrucción de la articulación.
A nivel celular, el papel patogénico de los neutrófilos en la AR involucra una alteración coordinada de varios procesos, incluyendo un aumento de la capacidad migratoria, una actividad inflamatoria anormal, así como un incremento del estrés oxidativo y la presencia incrementada de NETosis, un tipo de muerte celular de los neutrófilos caracterizada por la extrusión de una malla de cromatina unida a péptidos granulares denominados trampas extracelulares de neutrófilos (9, 10).
Asimismo, aunque el foco principal es la sinovitis, la AR presenta manifestaciones extra-articulares o comorbilidades asociadas, tales como enfermedad cardiovascular, síndrome metabólico, depresión, y osteoroposis entre otras (11), siendo la enfermedad cardiovascular la principal causa de mortalidad en estos pacientes (12). La comorbilidad cardiovascular en la AR deriva de varios procesos patogénicos presentes en estos pacientes: disfunción microvascular, arritmias, desregulación cardíaca, inflamación y anomalías inmunológicas, entre otras, así como del efecto de los tratamientos farmacológicos. Adicionalmente, en la AR se ha observado un incremento de aterosclerosis temprana comparado con la población general. Además, estos pacientes presentan un incremento en la prevalencia de resistencia a insulina (IR) que de manera general se manifiesta por una disminución en el transporte de glucosa inducido por la insulina en adipocitos y músculo esquelético, un aumento de la producción de glucosa hepática y alteraciones en el metabolismo de lípidos en tejido adiposo y hepático (13-15). La IR no afecta de la misma forma a los tejidos. En cada uno de ellos, la insulina ejerce un papel diferente y, por tanto, una alteración en la interacción con ella también afecta de manera diferente. El músculo, responsable del 20% del metabolismo de la glucosa, cuando es estimulado por la insulina, puede captar hasta un 80% de la glucosa sanguínea para su transformación en glucógeno. En casos de pacientes con resistencia a insulina, solo se capta entre un 30-40% de la glucosa que captaría una persona sana y la mayor parte de este descenso se debe al músculo (15). De éste modo, podemos decir que la inflamación juega un papel fundamental en el desarrollo de resistencia a la insulina, de forma que los niveles séricos de citoquinas inflamatorias son importantes para el metabolismo lipídico y glucídico, ya que tanto su exceso como su déficit se puede relacionar con diferentes estadios de resistencia a insulina (16).
El término “epigénetica” se refiere a aquellas alteraciones heredables que no son debidas a los cambios en la secuencia de ADN. Las modificaciones epigenéticas pueden estar mediadas por diferentes mecanismos, tales como la metilación del ADN, modificación de histonas y la regulación por ARNs no codificantes. Estos alteran la accesibilidad al ADN y la estructura de la cromatina, regulando patrones de expresión génica. Estos procesos son esenciales para el desarrollo y diferenciación normal de los diferentes linajes celulares en organismos adultos y su alteración se ha asociado al desarrollo de diferentes condiciones patológicas (17, 18). Los miRNAs son ARNs monocatenarios no codificantes de unos 18-25 nucleótidos que se unen por complementariedad en su secuencia a las regiones no traducidas 3´UTR de los ARN mensajeros (ARNm) dianas para suprimir la traducción de proteínas o bien promover la degradación del ARNm (19).
En las últimas décadas, los miRNAs se han postulado como importantes moléculas reguladoras de numerosas vías celulares y de desarrollo (20, 21). Numerosos estudios se han centrado en la evaluación de los niveles de expresión de miRNAs y han mostrado cambios considerables en sus perfiles de expresión en diversas enfermedades (22, 23). Un aspecto relevante a nivel clínico es que los resultados de estos estudios apuntan al perfil de la expresión de miRNAs como una herramienta potencialmente útil para el pronóstico, diagnóstico y tratamiento de enfermedades (22, 24, 25). Avances recientes confieren un papel a los ARN no codificantes, especialmente los miRNAs, en la progresión y el mantenimiento de la respuesta inflamatoria. Varios miRNAs, tales como miR-126, miR-132, miR-146, miR-155 y miR-221 han surgido como importantes reguladores de algunos mediadores inflamatorios importantes (26). En cuanto a las enfermedades autoinmunes, los miRNAs muestran una expresión alterada en varios tipos celulares en estos pacientes (27-32). Esta expresión alterada ha sido asociada con rutas de señalización inflamatorias que promueven la secreción de citoquinas pro-inflamatorias y otros procesos que mantienen el ciclo de la autoinmunidad (33).
Además, los miRNAs han demostrado una alta estabilidad en tejidos y plasma humano. De hecho, la mayoría de los perfiles de expresión de miRNAs, realizados en fluidos corporales de diversas patologías, indican que los miRNAs circulantes están protegidos frente a la actividad RNAsa endógena al ser transportados en el interior de exosomas o microvesiculas. Así, se ha sugerido que los miRNAs podrían actuar como moléculas de comunicación intercelular. Los exosomas son vesículas endocíticas derivadas de membranas celulares, con un tamaño de 30-120nm, que participan en la comunicación célula-célula y trasvase de proteína y ARN. Los miRNAs transportados en exosomas pueden ser absorbidos por células contiguas o distantes y modular de este modo la fisiología de determinadas células receptoras (34, 35).
En suma, aunque la utilidad diagnóstica de los miRNAs en enfermedades autoinmunes está por explorar, los estudios desarrollados en el ámbito de estas patologías sugieren que el estudio del perfil de expresión de miRNAs circulantes podría permitir la identificación de biomarcadores potenciales de diagnóstico, pronóstico o actividad de enfermedad.
2. Contenido de la investigación.
El objetivo principal de esta tesis es investigar el papel de la inflamación y los miRNAs en la patogénesis del SAF y la AR, mediante la integración de aproximaciones inmunológicas, celulares, moleculares y epigenéticas. Los principales resultados obtenidos fueron los siguientes:
1- Hemos identificado una firma molecular de miRNAs circulantes como potenciales biomarcadores de enfermedad en el SAF. Esta firma se asoció a la ocurrencia de pérdidas fetales, aterosclerosis y trombosis y correlacionó con parámetros de inflamación, trombosis y autoinmunidad. Además, dicha firma permaneció estable en el tiempo, hecho demostrado por análisis realizados en un intervalo de tiempo de 3 meses. Asimismo, se demostró la especificidad de la firma de miRNAs en pacientes SAF, mediante el análisis paralelo de dos cohortes de pacientes con trombosis pero sin enfermedad autoinmune y pacientes con Lupus Eritematoso Sistémico sin anticuerpos antifosfolípido, los cuales presentaban perfiles diferenciales. De modo complementario, el análisis mediante clústeres permitió establecer grupos de pacientes con diferente riesgo trombótico y expresión de miRNAs. Estudios mecanísticos in vitro revelaron que los anticuerpos antifosfolípidos promovían la desregulación del perfil de miRNAs analizado y sus potenciales proteínas diana en monocitos y células endoteliales. En suma, se ha identificado una firma de miRNAs diferencialmente expresados en pacientes con SAF como potenciales biomarcadores de la enfermedad que permiten tipificar el estado aterotrombótico de estos pacientes, constituyendo una posible herramienta en la práctica clínica habitual.
2- El estudio del perfil de expresión de miRNAs en neutrófilos de pacientes con AR demostró una reducción global de su expresión, asociado al descenso de genes involucrados en su biogénesis (DICER), así como una sobre-expresión de sus potenciales genes diana involucrados en inflamación y migración celular. Además, dichos niveles reducidos de miRNAs y DICER correlacionaron con mediadores de autoinmunidad, inflamación y el índice de actividad de la enfermedad. Los estudios in vitro revelaron que los anticuerpos antipéptidos cíclico citrulinados (ACPAs) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-) promovían una reducción tanto de la expresión de estos miRNAs como de los genes involucrados en su biogénesis, en paralelo al incremento de sus potenciales genes diana. El tratamiento concomitante con fármacos inhibidores de TNF-revirtió dichos efectos. Transfecciones con agonistas de varios de estos miRNAs mostraron también la especificidad de regulación de sus genes diana asociados con inflamación, supervivencia y migración celular. Adicionalmente, el silenciamiento del gen clave en el proceso de biogénesis de miRNAs, DICER, influenció de manera significativa el perfil inflamatorio de los neutrófilos. En suma, los neutrófilos en el contexto de AR exhiben una reducida expresión de miRNAs, promovida por los principales inductores de la activación patogénica de este tipo celular: autoanticuerpos y mediadores inflamatorios. Asimismo, la maquinaria de biogénesis de miRNAs se encuentra significativamente alterada en los neutrófilos de estos pacientes y fuertemente asociada con una desregulación de los miRNAs relacionados con la migración e inflamación en neutrófilos sinoviales. Finalmente, terapias dirigidas contra TNF- podrían modular estos niveles de expresión de miRNAs, minimizando de este modo el perfil inflamatorio.
3- El estudio de la actividad inflamatoria en pacientes con AR y su implicación en la alteración del metabolismo glucídico y lipídico demostró, en primer lugar, que los pacientes con AR mostraron una fuerte asociación entre el grado de inflamación sistémica y el desarrollo de resistencia a insulina. Estos resultados fueron corroborados mediante el desarrollo de un modelo murino de artritis inducida por colágeno que resultó en un estado de inflamación global caracterizado por un metabolismo defectuoso de la glucosa y de los lípidos en diferentes tejidos, siendo el tejido adiposo el principal tejido afectado y el más susceptible a las alteraciones inducidas por la AR. Estos resultados fueron confirmados asimismo mediante estudios in vitro, tras tratamiento de adipocitos con el suero de pacientes con AR. En su conjunto, los datos obtenidos en este estudio han mostrado cómo las alteraciones metabólicas observadas en pacientes AR dependen del grado de inflamación e identifica al tejido adiposo como el principal tejido diana para el desarrollo de resistencia a insulina. Por tanto, estrategias terapéuticas dirigidas a controlar el estatus inflamatorio podrían permitir normalizar o prevenir las alteraciones metabólicas asociadas con la AR.
3.Conclusión.
1- En el plasma de los pacientes con síndrome antifosfolípido existe una firma de microRNAs (miRNAs) diferencialmente expresados, modulados por los autoanticuerpos antifosfolípidos y asociados con el estatus aterotrombótico presente en esta patología autoinmune. Dichos miRNAs podrían por tanto ser considerados como nuevos biomarcadores de enfermedad, constituyendo una herramienta útil para el manejo clínico de estos pacientes.
2- Los neutrófilos de sangre periférica y líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide exhiben una reducción generalizada de los niveles de miRNAs, promovida tanto por anticuerpos anti-péptidos cíclicos critrulinados como por mediadores inflamatorios, que podría contribuir a su perfil patogénico. En consonancia con dicha expresión reducida, la biogénesis de miRNAs está significativamente alterada en los neutrófilos de estos pacientes, y se asocia con una regulación negativa más acentuada de los miRNAs relacionados con la migración y la inflamación en los neutrófilos sinoviales. Los tratamientos con fármacos dirigidos contra el TNF-y el receptor de la IL-6 modulan los niveles de miRNAs en los neutrófilos, minimizando su perfil inflamatorio.
3- La inflamación crónica presente en la artritis reumatoide puede inducir alteraciones en el metabolismo de la glucosa y los lípidos en los tejidos metabólicos, afectando principalmente al tejido adiposo, favoreciendo así el desarrollo de resistencia a la insulina. Por tanto, la aplicación de estrategias terapéuticas basadas en un control mas estricto de la inflamación podría contribuir a normalizar y prevenir las alteraciones metabólicas asociadas a la AR.
En suma, los resultados globales obtenidos en esta tesis doctoral han permitido identificar potenciales biomarcadores del status de la enfermedad y sus comorbilidades en pacientes con Síndrome Antifosfolípido y Artritis Reumatoide, así como diversos mecanismos moleculares asociados a procesos patológicos clave en estas enfermedades, tales como la enfermedad cardiovascular. Dichos resultados podrían sentar las bases para la realización de estudios futuros, cuyo fin sea desarrollar una medicina personalizada dirigida a optimizar el cuidado de los pacientes con enfermedades autoinmunes sistémicas.
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