Nuevas estrategias para la mejora de la sensibilidad y la selectividad en el análisis de biomarcadores proteómicos y mirnómicos en fluidos biológicos mediante ce-ms
- Autores: Roger Peró Gascón
- Directores de la Tesis: Victòria Sanz Nebot (dir. tes.), Fernando Julián Benavente Moreno (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2020
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Alberto Escarpa Miguel (presid.), Javier Saurina Purroy (secret.), Rawi Ramautar (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Química Analítica y Medio Ambiente por la Universidad de Barcelona
- Materias:
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- Resumen
En las últimas décadas, el análisis de compuestos biomarcadores en muestras biológicas se ha convertido en una herramienta esencial para el diagnóstico, seguimiento y pronóstico de diversas enfermedades. Las principales dificultades en muchos casos son la baja concentración de los biomarcadores, la complejidad de la matriz de la muestra y la limitada disponibilidad de muestra. En esta tesis doctoral, se presentan nuevas estrategias basadas en electroforesis capilar-espectrometría de masas (CE-MS) para la separación, detección, caracterización y cuantificación de péptidos, proteínas y microARNs (miRNAs) biomarcadores en fluidos biológicos.
La MS es una técnica excelente para la identificación inequívoca de los analitos de interés debido a su selectividad y potencial respecto a la caracterización estructural detallada de compuestos desconocidos. Sin embargo, debido a la sensibilidad necesaria y a la complejidad de la mayoría de las muestras biológicas, es imprescindible su acoplamiento con las técnicas de separación de alta resolución. En este sentido, la CE es una técnica a microescala muy adecuada para la separación de biomoléculas cargadas. Sin embargo, para obtener separaciones rápidas, eficaces y de elevada resolución, los métodos de separación electroforéticos deben ser optimizados convenientemente. En esta tesis, se han desarrollado estrategias novedosas para la predicción y optimización de las separaciones de mezclas complejas de péptidos en CE. Para evaluar estas estrategias, se han estudiado los péptidos beta amiloides, biomarcadores de la enfermedad de Alzheimer.
Una limitación importante de la CE es su baja sensibilidad en términos de concentración para la mayoría de analitos a causa del pequeño volumen de inyección de muestra. La extracción en fase sólida en línea con la electroforesis capilar (SPE-CE) es una excelente estrategia para disminuir los límites de detección. En SPE-CE unidireccional, la configuración más habitual, se inserta cerca de la entrada del capilar de separación un preconcentrador o microcartucho de extracción, que contiene un sorbente adecuado para retener selectivamente los analitos de interés. De esta manera, es posible introducir grandes volúmenes de muestra y eluir los analitos retenidos en un volumen muy inferior de una solución adecuada, consiguiendo la purificación y preconcentración de los analitos de interés con una manipulación mínima. En esta tesis se han investigado metodologías de SPE-CE-MS unidireccional empleando sorbentes selectivos, como los sorbentes de inmunoafinidad, afinidad a aptámero, afinidad a metal inmovilizado y el carburo de silicio, para el análisis de proteínas intactas como la transtiretina, biomarcador de la polineuropatía amiloidótica familiar tipo I, y la α-sinucleína, relacionada con la enfermedad de Parkinson, digestos de proteínas y miRNAs, relacionados con el cáncer, en fluidos biológicos.
La SPE-CE-MS unidireccional es una excelente estrategia para el análisis de moléculas biomarcadoras en fluidos biológicos. Sin embargo, esta sencilla configuración presenta algunas limitaciones intrínsecas. Por un lado, los volúmenes de muestra introducidos mediante presión dependen de las dimensiones del capilar de separación. Por otro lado, la introducción de la muestra, los lavados y el llenado del capilar con BGE antes de la elución de los compuestos retenidos tienen lugar en la misma dirección que la posterior separación. Por tanto, al cargar una muestra biológica compleja o durante la etapa de lavado posterior, los componentes de la matriz de la muestra pueden modificar irreversiblemente la pared interna del capilar. Además, en muchos casos, los requisitos de la preconcentración en línea son incompatibles con el BGE necesario para una separación eficaz por CE y una detección sensible por MS. En esta tesis se ha investigado el potencial de la SPE-CE-MS con una nanoválvula (nvSPE-CE-MS) para solucionar estos inconvenientes. Se ha desarrollado un método de nvSPE-CE-MS empleando un sorbente C18 para el análisis de péptidos opioides y péptidos beta amiloides en plasma humano y se han comparado las ventajas e inconvenientes de la nvSPE-CE-MS respecto a la SPE-CE-MS unidireccional.
Finalmente, se han investigado nuevas estrategias para el análisis de digestos de proteínas de forma rápida y eficiente. La tripsina es la enzima proteolítica más comúnmente utilizada y la digestión se realiza habitualmente en disolución, requiriéndose largos tiempos de digestión. Como alternativa, se han propuesto las enzimas inmovilizadas en un soporte, que permiten disminuir el volumen de muestra, su manipulación y el tiempo total de análisis y mejorar la eficiencia de la digestión, así como estabilizar y reutilizar la enzima o evitar su autoproteólisis. Con el objetivo de incrementar la capacidad de procesar muestras y minimizar la manipulación, en esta tesis se ha desarrollado una metodología de análisis de proteínas empleando microrreactores empaquetados con partículas con tripsina inmovilizada en línea con la CE-MS (IMER-CE-MS).
