Resumen de Nuevas interacciones de la proteína MNT y su efecto en regulación transcripcional
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MNT, perteneciente a la familia MXD, se considera un antagonista y modulador de MYC, una de las oncoproteínas más frecuentemente alteradas en cáncer. La actividad de MYC es muy amplia al regular procesos como el ciclo celular, la diferenciación, el crecimiento celular, el metabolismo o la apoptosis. Tanto MYC como las MXDs son factores de transcripción de tipo hélice-bucle-hélice/cremallera de leucina (bHLHLZ) que heterodimerizan con MAX, se unen a secuencias específicas en el ADN denominadas E-boxes, generalmente activando (MYC-MAX) o reprimiendo (MXD-MAX) la transcripción de genes diana.
MNT destaca entre el resto de las proteínas MXDs por varias razones. Primero, es el único homólogo de la familia MXD en Drosophila melanogaster, el mayor en tamaño y con expresión más ubicua. La falta de MNT en ratones resulta en defectos craneofaciales, deficiencias en el desarrollo embriónico y muerte a los pocos días del nacimiento, mientras que la deficiencia en Mxd1, Mxd2 o Mxd3 no afecta a la viabilidad. La pérdida de MNT suele provocar un fenotipo muy similar al de la sobreexpresión de MYC. Además, un reciente estudio muestra que la deleción de MNT en cáncer tiene una frecuencia del 10%. Sin embargo, la deficiencia de MNT en otros modelos puede disminuir la tumorogénesis dependiente de MYC. Esto es debido a la función pro-supervivencia de MNT, que contrarresta la apoptosis causada por un exceso de MYC.
Hasta ahora, las funciones de MNT siempre se han asociado a su actividad con MAX. Sin embargo, desde que se describieron líneas celulares y tumores deficientes en MAX, se abrió la posibilidad de que existieran funciones de MNT aún desconocidas e independientes de MAX. Nuestros resultados previos parten de la línea celular UR61, derivada la línea celular PC12 de feocromocitoma de rata y que expresa una forma no funcional de la proteína MAX a causa de una deleción.
En primer lugar, se llevó a cabo un análisis proteómico previo en nuestro laboratorio (Mª Carmen Lafita y el grupo de Alex von Kriegsheim en Conway Institute of Biomolecular and Biomedical Research, Dublín) de inmunoprecipitados de MNT en UR61. En seis experimentos independientes se obtuvieron cinco proteínas, una de las cuales era REL, miembro de la familia NF-κB, para su posterior estudio en esta tesis. Las proteínas NF-κB se encuentran presentes en casi todos los tipos celulares y están implicados en múltiples procesos biológicos, tales como inflamación, inmunidad, diferenciación, crecimiento celular y apoptosis. REL se encuentra alterado en diferentes tipos de tumores, principalmente de tipo linfoide pero también en tumores sólidos.
Los resultados obtenidos conducen a las siguientes conclusiones: (i) MNT interacciona con REL, tanto en el núcleo como en el citoplasma, independientemente de MAX. (ii) El silenciamiento de MNT provoca la translocación de REL al núcleo, la activación de la vía de señalización de NF-κB y el aumento en dos dianas de REL: IκBα and BCL-XL.(iii) MNT reprime NFKBIA (que codifica para IκBα) por medio de la unión directa a regiones reguladoras de su gen. El pico máximo de unión se detecta en +171/+343 con respecto al punto de inicio de la transcripción y coincide con el pico de unión de REL en el gen NFKBIA.
En segundo lugar, se ha descrito que MLX, una proteína similar a MAX, puede interaccionar con MXD1, MXD4 y MNT. MLX también es un factor de transcripción de tipo bHLHLZ y está implicado en estrés metabólico y respuesta a nutrientes junto con MLXIP y MLXIPL. En estudios previos de nuestro grupo, se observó que MNT era necesario para la óptima proliferación de células UR61, carentes de MAX, y que regulaba la expresión de un grupo de genes (Lafita-Navarro, Tesis 2015). Al ser todo ello en ausencia de MAX, nos planteamos si MNT lo estaba llevando a cabo interaccionando con MLX. Otra posibilidad era que estuviera formando homodímeros, tal y como había detectado Meroni et al., (1997) por ensayos de doble híbrido y co-inmunoprecipitaciones in vitro.
A partir de los resultados obtenidos, concluimos que: (i) MNT forma homodímeros y heterodímeros con MLX en células UR61 a través del dominio bHLH. (ii) Los dímeros MNT-MLX se localizan tanto en el citoplasma como en el núcleo y son necesarios para la proliferación óptima de las células en ausencia de MAX. (iii) MNT regula la expresión de genes implicados en ciclo celular y reparación del ADN en ausencia de MAX. (iv) MNT se une directamente a BIRC5, CDK1 and BRCA1 (para activar su transcripción) y a FBXO32, CCNG2 and ERCC6 (para reprimir su transcripción). (v) MNT se une a E-boxes y a motivos de unión de factores de transcripción de tipo forkhead en ausencia de MAX. (vi) MNT autorregula negativamente su promotor a través de la E-box 2 (CATGTG) situada a -788 del punto de inicio de la transcripción, en colaboración con MAX. (vii) MNT se encuentra en exceso en las células deficientes en MAX y no es posible llevar a cabo su sobreexpresión.
Por último, empleamos el modelo celular HAP1 knockout para MNT con el fin de determinar nuevas dianas de MNT. Para ello analizamos su transcriptoma por RNA-seq y analizamos el papel de MAX y de MLX en la regulación de las nuevas dianas obtenidas de MNT. Nuestros resultados muestran que: (i) Las células HAP1 knockout para MNT proliferan más rápido, incluso a pesar de tener niveles más bajos de MYC. (ii) MNT regula la transcripción génica tanto como un activador como un represor, en complejos MNT-MAX, MNT-MLX o MNT-MNT/?, afectando a múltiples procesos celulares, incluyendo desarrollo, proliferación, diferenciación o respuesta a estímulos externos.
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- English
MNT is a transcription factor from the MXD family known to be an important modulator of the activity of the oncoprotein MYC. Both MYC and MXD proteins are basic helix-loop helix leucine zipper (bHLHLZ) transcription factors that heterodimerize with MAX, bind to E-boxes within regulatory regions of target genes, and generally activate (MYC) or repress (MXD) their transcription. However, little is known about the MYC and MXD functions beyond MAX interaction. Here we provide evidence of a novel MAX independent interaction between MNT and REL, and a new function of MNT as a regulator of the NF-KB pathway. In addition, we confirm the ability of MNT to form homodimers and heterodimers with MLX and we study their function as transcriptional regulators in the absence of MAX. Finally, we describe new MNT target genes by using a human MNTknockout model. These novel target genes are involved in different cellular processes, such as development, proliferation, differentiation or response to externa! stimulus. Taken together, our results widen our knowledge about MNT beyond MAX interaction and provide new evidences of the key role of MNT in the MYC proximal network.
