Resumen de Síntesi de lipopèptids i de pèptids conjugats derivats de bp100. Caracterizació estructural de lipopèptids lineals i cíclics
Actualmente se calcula que, aproximadamente, un tercio de la producción agrícola se pierde a causa de los daños provocados por las plagas, resultando en un impacto económico muy importante. Se estima que alrededor de un tercio de estas pérdidas son provocadas por fitopatógenos. Hoy en día, la solución a estos problemas se centra en el uso de pesticidas, esencialmente derivados de cobre, antibióticos o fungicidas. Estos compuestos, aunque eficaces, son altamente contaminantes. Además, los antibióticos no están permitidos en muchos países, porque un uso abusivo provoca la aparición rápida de cepas bacterianas resistentes.
La ausencia de tratamientos no contaminantes y efectivos para el control de enfermedades de plantas ha motivado la búsqueda de nuevos compuestos. Los péptidos antimicrobianos (AMPs) son una de las alternativas más prometedoras a los pesticidas tradicionales, porque muestran una actividad biológica elevada, a la vez que es difícil que provoquen la aparición de cepas bacterianas resistentes. En este ámbito, el grupo LIPPSO, en colaboración con el grupo CIDSAV, ha identificado el péptido H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Tyr-Leu-NH2 (BP100) que presenta actividad antibacteriana elevada frente a patógenos de plantas y baja hemólisis. Este perfil biológico hace que BP100 sea un candidato excelente para la búsqueda de nuevas secuencias que puedan ser usadas para el control de enfermedades de plantas. Por este motivo, en esta tesis doctoral se planteó el diseño y la síntesis de derivados de BP100. Con este objetivo se consideraron tres estrategias, concretamente, la incorporación de un grupo acilo a la secuencia de BP100, la conjugación de BP100 con otro péptido y la derivatización de BP100 con un pesticida convencional.
En la bibliografía se ha descrito que la acilación de una secuencia peptídica es una estrategia útil para aumentar su actividad biológica, así como para mejorar su estabilidad a la degradación por proteasas. En base a estas consideraciones, uno de los objetivos de esta tesis fue la preparación de lipopéptidos derivados de BP100 por acilación (con un grupo butanoílo, hexanoílo o lauroílo) del extremo N-terminal o de la cadena lateral de un residuo de lisina localizada en cada una de las posiciones de la secuencia. Además, se estudió la influencia de incorporar D-aminoácidos o un residuo de His en la secuencia de estos lipopéptidos. Los resultados obtenidos mostraron que, en general, los lipopéptidos derivados de BP100 con un mejor perfil biológico son los que contienen una D-Phe en la posición 4, una lisina acilada con un grupo butanoílo o hexanoílo en las posiciones 3, 4, 7, 8, 10 o 11, correspondientes a la cara apolar de la hélice α que podrían adoptar estos péptidos. En concreto, el lipopéptido con el mejor perfil biológico fue Ac-Lys-Lys-Leu-D-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Lys(COC3H7)-Leu-NH2 (BP475), que presenta una CMI entre 0,8 i 6,2 µM frente a los 8 fitopatógenos testados y no es hemolítico a 250 µM.
La conjugación de péptidos, con actividades biológicas parecidas o diferentes, para generar un péptido híbrido es una estrategia útil para sumar las propiedades de cada una de estas unidades. En el segundo objetivo de esta tesis se diseñaron y sintetizaron péptidos conjugados resultantes de la unión de un lipopéptido derivado de BP100 (BP387 o BP475) con un AMP (BP143), un péptido penetrador de células (CPP) (BP16 o BP100) o un péptido elicitor de defensas de plantas (flg15 o Pip1). En general, se observó que los lipopéptidos conjugados que incorporan un CPP o un AMP presentan una actividad antibacteriana baja y una actividad hemolítica elevada. En cambio, los lipopéptidos conjugados que contienen un péptido elicitor de defensas de plantas muestran una actividad antibacteriana moderada o elevada, y una toxicidad baja o moderada. Los lipopéptidos conjugados que presentan el mejor perfil biológico fueron Pip1-BP475 y BP475-Pip1, con una CMI entre 0,8 y 6,2 µM frente a 5 de los 6 fitopatógenos testados y una hemólisis <26% a 250 µM.
Por otro lado, está descrito que la unión covalente de un antibiótico o un fungicida a una secuencia peptídica es una estrategia útil para conseguir compuestos más efectivos. En base a esto, en el tercer objetivo de esta tesis se planteó la conjugación de BP100 con el antibiótico estreptomicina, y los fungicidas valifenalato y quinoxifeno. Así, se obtuvieron los péptidos BP493, BP523 y BP524, resultantes de la incorporación en el extremo N-terminal de BP100 de una quinolona derivada de quinoxifeno, un derivado de valifenatalo y de estreptomicina, respectivamente. De estos, BP524 fue el que presentó un mejor perfil de actividad biológica, con una CMI <6,2 µM frente a las 6 bacterias testadas y una hemólisis del 57% a 50 µM.
En la última parte de esta tesis, se caracterizó mediante resonancia magnética nuclear (RMN) el lipopéptido BP475. A partir de esta caracterización, se determinó que cinco aminoácidos del extremo C-terminal de BP475 pueden adoptar una estructura de hélice α. Por otro parte, en el grupo LIPPSO se habían descrito estrategias de síntesis en fase solida de derivados de fengicinas y de arilomicina A, pero los compuestos obtenidos no se habían podido caracterizar mediante RMN. En esta tesis se sintetizaron y purificaron seis derivados de fengicinas y un derivado de arilomicina A, y se caracterizaron mediante RMN.
