Resumen de Lipin-2 regulates palmitic acid-induced nlrp3 inflammasome activation in macrophages
INTRODUCCIÓN El sistema inmune tiene la capacidad de detectar rápidamente agentes patógenos y desencadenar una respuesta frente a ellos para eliminarlos. Dicha respuesta es la inflamación, caracterizada por rubor, calor, dolor, hinchazón y pérdida de función.
Para la activación del inflamasoma NLRP3 y la consecuente producción de IL-1b son necesarias dos señales, una primera señal, llamada priming, necesaria para la expresión de la pro-IL-1b y la proteína NLRP3. Después, durante una segunda señal, se produce el ensamblaje del inflamasoma que dará lugar a la activación de la caspasa-1, que producirá la maduración de la pro-IL-1β y la pro-IL-18 a IL-1β e IL-18, que serán liberadas de la célula para ejercer su función como pirógenos.
OBJETIVOS Teniendo en cuenta los antecedentes descritos anteriormente, el objetivo principal de este trabajo de Tesis Doctoral ha sido determinar el papel de la lipina-2 en la activación del inflamasoma NLPR3 en respuesta a ácido grasos saturados en macrófagos.
Para ello este objetivo principal se ha dividido en varios objetivos específicos: 1. Estudiar el papel de la lipina-2 en la primera señal de activación del inflamasoma, determinando sus efectos sobre la señalización por TLR, en macrófagos de origen múrido y humano.
2. Estudiar el papel de la lipina-2 en la segunda señal de activación del inflamasoma, definiendo sus efectos sobre los eventos que ocurren durante la activación del inflamasoma como la activación de la caspasa-1, la salida de potasio o la piroptosis.
3. Estudiar el papel de la lipina-2 en el estrés de retículo endoplásmico generado por ácido palmítico, determinando sus efectos sobre la activación del inflamasoma.
4. Estudiar el papel de la lipina-2 en la ruta de activación no-canónica del inflamasoma.
MATERIALES Y MÉTODOS • Células: Se emplearon los siguientes tipos celulares: línea celular macrofágica de ratón RAW 264.7, macrófagos derivados de médula ósea (BMDM) de ratones Wt y Lpin2-/-, macrófagos derivados de médula ósea inmortalizados (iBMDM), línea celular de fibroblastos L-929, línea celular de macrófagos alveolares AMJ2-C11 y macrófagos humanos derivados de monocitos de sangre periférica obtenida de voluntarios sanos del Centro de Hemoterapia y Hemodonación de Castilla y León (Valladolid).
• Reactivos: LPS, ácido palmítico complejado a albúmina libre de ácidos grasos (BSA) (ratio 3,4:1), LPC (16:0), LPC (18:1), inhibidores de MAPKs, inhibidores de estrés de retículo (particularmente inhibidores de IRE1α y PERK), inhibidor de CD36 e inhibidores de fosfolipasas A2. • Inmortalización de BMDM: La inmortalización de las BMDM se realizó mediante la infección con retrovirus J2 que contenían los oncogenes v-raf y v-myc.
• ELISA: Siguiendo las instrucciones del fabricante se emplearon ELISAs específicos para cuantificar la IL-1β en sobrenadantes de células múridas y humanas tras tu activación.
• Inmunodetección de proteínas (immunoblot): Tras la estimulación, las células fueron lisadas y la proteína cuantificada mediante el método de Bradford. 50 µg de proteína fueron analizados mediante immunoblot empleando anticuerpos específicos y se visualizaron mediante quimioluminiscencia.
• RT-qPCR: Se extrajo el ARN total de las células activadas y se sintetizo el cDNA mediante RT-PCR. La PCR cuantitativa a tiempo real (RT-qPCR) se llevó a cabo en un LightCycler 480 y la expresión relativa de ARNm se obtuvo mediante el método de ΔΔCt.
• Transfección de siRNAs: Los macrófagos humanos fueron transfectados de forma transitoria mediante nucleofección de siRNAs empleando el protocolo optimizado de Amaxa. Las células RAW 264.7 y iBMDM fueron transfectadas con siRNAs mediante el uso de la Lipofectamina RNAiMAX.
• Citometría de flujo: La citometría de flujo fue empleada para analizar la activación de caspasa-1 mediante el kit comercial FAM-FLICA, la producción de ROS mitocondriales mediante la sonda MitoSOX y la muerte celular mediante tinción con ioduro de propidio y Annexin V. La fluorescencia fue analizada en un citómetro Gallios (Beckman Coulter). El análisis de las poblaciones fue realizado mediante el software Kaluza.
• Espectrometría de emisión atómica de plasma (ICP-OES): La concentración de potasio intracelular fue analizado mediante un espectrómetro de emisión atómica de plasma (ICP-OES) Varian 725-ES.
• Medida de lípidos: Se extrajeron los lípidos de un extracto celular correspondiente a 1 mg de proteína. Se analizaron las distintas especies de oxPAPC y lisofosfolípidos (LPC, LPE) mediante HPLC/espectrometría de masas.
• Análisis estadístico: Los datos se expresan como la media ± desviación estándar. Las comparaciones estadísticas de los grupos de datos se realizaron mediante la prueba T de 2 colas, en la cual valores de p menores a 0,05 fueron considerados significativos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los pacientes con síndrome de Majeed presentan altas cantidades de citoquinas como la IL-1β y el TNFα en sangre. Sin embargo, solo el tratamiento con bloqueantes de la IL-1β o su receptor mejoran los síntomas clínicos, lo que sugiere que la IL-1β y por consiguiente la activación del inflamasoma son eventos clave en la patogénesis de esta enfermedad. Por ello, el objetivo principal del presente trabajo de Tesis Doctoral ha sido el estudio del papel de la lipina-2 en la activación del inflamasoma NLRP3. Para ello se ha analizado la activación del inflamasoma NLPR3 en respuesta a ácido palmítico cuando la lipina-2 está ausente o sus niveles han sido reducidos mediante tecnología de siRNAs.
1. La ausencia de lipina-2 conlleva una producción exacerbada de IL-1β en respuesta a ácido palmítico dependiente del inflamasoma NLRP3.
En primer lugar, se quiso comprobar que la ausencia de lipina-2 en células in vitro también desencadenaba una producción exacerbada de IL-1β como ocurría en pacientes con síndrome de Majeed. Para ello, se analizó la producción de IL-1β en respuesta a ácido palmítico, y se pudo comprobar que la producción de IL-1β era mayor en ausencia de lipina-2 y que esta producción era dependiente de NLRP3, lo que sugiere que la lipina-2 modula la activación del inflamasoma NLRP3 en respuesta a ácidos grasos saturados.
Una vez demostrado que el inflamasoma NLRP3 estaba siendo activado, se quiso estudiar en detalle que proceso estaba siendo afectado por la ausencia de lipina-2, y se analizaron tanto la primera señal como la segunda señal de activación del inflamasoma. Cabe destacar que el ácido palmítico puede activar tanto la primera señal como la segunda señal de activación del inflamasoma; sin embargo, desencadena una primera señal muy tenue por lo que en algunos experimentos se empleo el LPS como primera señal.
2. La ausencia de lipina-2 produce una mayor activación de la primera señal de activación del inflamasoma NLRP3 en respuesta a ácido palmítico.
Para analizar si la lipina-2 estaba regulando la primera señal de activación del inflamasoma, se analizó la expresión de la pro-IL-1β y de distintos componentes del inflamasoma en respuesta a ácido palmítico, y se comprobó que en ausencia de lipina-2 la expresión de la pro-IL-1β y del NLRP3 estaba aumentada; sin embargo, no se vieron cambios en la expresión de caspasa-1, la cual se expresa de manera constitutiva. Además, se pudo comprobar que la inducción de la expresión de la Il1b se debía a la activación de las MAPKs, teniendo p38 un mayor papel cuando lipina-2 estaba ausente. Además de la Il1b, se pudo comprobar que la ausencia de lipina-2 también afectaba a la expresión de otra citoquina pro-inflamatoria como es la Il6. Estos datos sugieren que la lipina-2 regula la señalización celular en respuesta a ácido palmítico.
3. La ausencia de lipina-2 produce una activación exacerbada de la segunda señal de activación del inflamasoma NLRP3 en respuesta a ácido palmítico.
Una vez comprobado que la primera señal estaba afectada por la ausencia de lipina-2, se quiso comprobar si la segunda señal también estaba afectada. Para ello se analizaron eventos clave que ocurren durante la segunda señal de activación del inflamasoma como son la activación de caspasa-1, la salida de potasio y la muerte celular. Se pudo comprobar que en ausencia de lipina-2 se producía una mayor activación de caspasa-1 y mayor muerte celular; sin embargo, no se producía mayor salida de potasio tras la activación con ácido palmítico. Estos datos sugieren que la lipina-2 también regula la segunda señal de activación del inflamasoma. Además, se pudo comprobar que el transportador de ácidos grasos CD36 era necesario para la producción de IL-1β en respuesta a ácido palmítico.
4. La ausencia de lipina-2 produce un estrés de retículo endoplásmico (RE) exacerbado en respuesta a ácido palmítico.
En la literatura está descrito que el ácido palmítico produce estrés de retículo. Por ello se quiso estudiar si la ausencia de lipina-2 podría estar afectando a este tipo de estrés. Para ello se analizó la expresión de marcadores de estrés de RE como CHOP y BiP y se vio que ambos estaban aumentados cuando la lipina-2 estaba ausente en respuesta a ácido palmítico. Lo que sugiere que la lipina-2 regula la aparición del estrés de RE en respuesta a ácidos grasos saturados.
5. El ácido palmítico produce activación del inflamasoma NLRP3 dependiente de IRE1α.
Recientemente, se ha descrito que el ácido palmítico activa el inflamasoma NLRP3 a través de la vía de IRE1α. Por ello se quiso estudiar si en nuestro sistema esta vía podría ser la responsable de la producción de IL-1β. Para ello se analizó la producción de IL-1β y la activación de caspasa-1 en presencia de inhibidores tanto de IRE1α como de PERK, y se pudo comprobar que ambos sensores del RE eran necesarios para la producción de IL-1β en respuesta a ácido palmítico.
6. El ácido palmítico desencadena la vía no-canónica de activación del inflamasoma.
El LPS intracelular es capaz de activar la vía no-canonica del inflamasoma, a través de su unión a caspasa-11. Dado que el ácido palmítico, al igual que el LPS, es capaz de activar ambas señales de activación del inflamasoma, se quiso analizar si el ácido palmítico también estaba desencadenando la activación de caspasa-11. Para ello se analizó la producción de IL-1β en ausencia de caspasa-11, y se comprobó que la caspasa-11 es necesaria para la producción de IL-1β en respuesta a ácido palmítico. Además, se pudo observar que en ausencia de lipina-2 existe una mayor expresión de caspasa-11, la cual podría ser la responsable de la mayor activación del inflamasoma en ausencia de lipina-2.
7. La ausencia de lipina-2 conlleva una producción exacerbada de IL-1β debido a una acumulación de lisofosfatidilcolina.
Por último, se quiso estudiar si algún derivado del ácido palmítico podría estar activando el inflamasoma. Para ello se analizó si el ácido palmítico estaba induciendo el acúmulo de especies como oxPAPC, las cuales está descrito que se pueden unir a caspasa-11 y activarla, además de especies de lisofosfolípidos que se ha visto que pueden tener efectos pro-inflamatorios. Se pudo observar que en ausencia de lipina-2 no se producían acúmulos de oxPAPC, pero si de LPC, particularmente LPC (16:0). Además, los acúmulos de LPC parecían ser responsables de la producción de IL-1β en respuesta a ácido palmítico, la cual era mayor en ausencia de lipina-2.
En resumen, se ha descrito que la lipina-2 regula la activación del inflamasoma NLRP3 en respuesta a ácido palmítico. Este trabajo muestra que la lipina-2 controla los eventos de señalización que ocurren durante la primera señal de activación del inflamasoma, reduciendo la generación de pro-IL-1β, en la que la MAPK p38 parece tener un papel importante. Además, se ha demostrado que la lipina-2 reduce la segunda fase de activación del inflamasoma, afectando a diferentes procesos celulares que culminan en la activación de la caspasa-1 y la maduración de la pro-IL-1β. La lipina-2 reduce el estrés de RE generado por ácido palmítico, el cual parece ser necesario para la producción de IL-1β dependiente de IRE1α y PERK. Desde un punto de vista lipidómico, la lipina-2 reduce los niveles de LPC generados por el tratamiento con ácido palmítico. Estos lípidos, y especialmente la LPC (16:0), cuando son añadidos exógenamente a macrófagos, tienen la capacidad de activar el inflamasoma no-canónico y producir IL-1β. Esta capacidad se pierde en células sin caspasa-11. Estos datos abren nuevas vías para controlar la inflamación y la activación del inflamasoma en aquellas enfermedades en las que los ácidos grasos saturados juegan un papel dañino.
