Síntesis y caracterización de poliaminoescuaramidas: estudios de agregación y actividad biológica
- Autores: Francisca Orvay Pintos
- Directores de la Tesis: Maria del Carmen Rotger Pons (dir. tes.), Antoni Costa Torres (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de les Illes Balears ( España ) en 2021
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Ana Maria Costero Nieto (presid.), Priam Francesc de Villalonga Smith (secret.), Raquel Pérez Herrera (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Ciencia y Tecnología Química por la Universidad de las Illes Balears
- Materias:
- Texto completo no disponible (Saber más ...)
- Resumen
- español
La terapia génica persigue tratar enfermedades y desórdenes de origen genético. Una extensión trascendente de la terapia génica es la corrección génica que se logra usando sistemas de tipo CRISPR/Cas9. En esencia, ambas técnicas se basan en la inserción de material genético exógeno a nivel celular con el fin de modificar la correspondiente expresión proteica. Aunque el potencial de desarrollo de las terapias génicas es enorme, existen obstáculos importantes que impiden un uso clínico habitual de dichas terapias.
Entre estos, son particularmente importantes los riesgos asociados a la bioseguridad y a la falta de efectividad de los tratamientos.
A nivel experimental, la inserción celular de cualquier tipo de ADN requiere la utilización de vectores de transfección. En esta labor, se utilizan vectores virales que poseen elevada efectividad, pero introducen riesgos biológicos. Como alternativa, se están desarrollando vectores de tipo químico (objetivo de la tesis) que, en general, presentan un menor riesgo biológico, pero cuya efectividad es limitada.
En primer lugar, se introduce al lector sobre las características estructurales de las escuaramidas, su capacidad de interacción con otras moléculas y las aplicaciones que surgen en diversos campos.
En el capítulo 3, se describen los experimentos realizados sobre un oligómero cíclico de dos unidades escuaramida (MC2). Aunque los experimentos previos a la Tesis parecían indicar que este compuesto podía presentar actividad transfectiva, el estudio recogido en esta Memoria, ha descartado cualquier tipo de actividad en este sentido. El compuesto MC2, del que se ha logrado su estructura de rayos X, puede presentar varias conformaciones. Se describe también la síntesis de una variante de MC2 soluble en disolventes apolares. El estudio realizado, en base a múltiples experimentos UV-Vis y RMN a temperatura y concentración variables, ha permitido descubrir hasta tres tipos de agregación y se ha demostrado la compleja interrelación que existe entre los distintos estados agregados.
El capítulo 4 profundiza en la idea inicial, en el sentido de que las oligoescuaramidas cíclicas podrían poseer actividad transfectiva, describiendo la síntesis de oligoescuaramidas cíclicas de una a ocho unidades escuaramida (MC1-MC8). Los cromatogramas GPC prueban la pureza de los oligómeros MC1 a MC4, pero al mismo tiempo han permitido descubrir que los macrociclos superiores (MC5 a MC8) contienen proporciones variables de otros oligómeros y detectar la formación de un material desconocido de elevado peso molecular. La evaluación de la actividad transfectiva de la serie indica cierta actividad transfectiva asociada a MC7 y MC8. En ningún caso se observa toxicidad celular reseñable.
En el capítulo 5, se plantea directamente qué polímeros de base escuaramida podrían ser responsables de la transfección. En este capítulo se describen varios procedimientos para la síntesis de polímeros de tipo poliaminoescuaramida (pASQUA) y su separación mediante precipitación fraccionada o mediante filtración centrífuga fraccional. Se ha caracterizado el material y se ha evaluado la actividad biológica del material responsable de la transfección.
El capítulo 6 se encuentra en la interfase de la química y la biología; donde se estudia la interacción pASQUA::ADN utilizando plásmidos y otros ácidos nucleicos. Se describen imágenes de los poliplejos obtenidas por AFM combinadas con mediciones de potencial zeta y diámetro hidrodinámico. Todo ello junto con los experimentos de desplazamiento de indicadores fluorescentes (FID) y siempre con la evaluación biológica ha demostrado la elevada capacidad de transfección de los polímeros pASQUA.
Algunos experimentos de transfección sobre organismos unicelulares realizados con éxito con pASQUA incluyen: protistas unicelulares (T. cruzi) formas epimastigote y amastigote. Monocercomonides (para los que no existe ningún método efectivo de transfección). Transformación extracelular de bacterias (Mycobacterium tuberculosis).
Transformación intracelular de bacterias (Rickettsia canadensis y Orientia tsutsugamushi) en células VERO. Transfecciones sobre líneas celulares inmortalizadas (HEK293; PC-3; SW480) y cultivos primarios.
- català
La teràpia gènica persegueix tractar malalties i desordres d'origen genètic. Una extensió transcendent de la teràpia gènica és la correcció gènica que s'aconsegueix usant sistemes de tipus CRISPR/Cas9. En essència, ambdues tècniques es basen en la inserció de material genètic exogen a nivell cel·lular amb la finalitat de modificar la corresponent expressió proteica. Encara que el potencial de desenvolupament de les teràpies gèniques és enorme, existeixen obstacles importants que impedeixen un ús clínic habitual d'aquestes teràpies. Entre aquests, són particularment importants els riscos associats a la bioseguretat i a la falta d'efectivitat dels tractaments.
A nivell experimental, la inserció cel·lular de qualsevol mena d'ADN requereix la utilització de vectors de transfecció. En aquesta tasca, s'utilitzen vectors virals que posseeixen elevada efectivitat, però introdueixen riscos biològics. Com a alternativa, s'estan desenvolupant vectors de tipus químic (objectiu de la tesi) que, en general, presenten un menor risc biològic, però l'efectivitat del qual és limitada.
En primer lloc, s'introdueix al lector sobre les característiques estructurals de les esquaramides, la seva capacitat d'interacció amb altres molècules i les aplicacions que sorgeixen en diversos camps.
En el capítol 3, es descriuen els experiments realitzats sobre un oligómer cíclic de dues unitats esquaramida (MC2). Encara que els experiments previs a la Tesi semblaven indicar que aquest compost podia presentar activitat transfectiva, l'estudi recollit en aquesta Memòria, ha descartat qualsevol tipus d'activitat en aquest sentit. El compost MC2, del qual s'ha aconseguit la seva estructura de raigs X, pot presentar diverses conformacions. Es descriu també la síntesi d'una variant de MC2 soluble en dissolvents apolars. L'estudi realitzat, sobre la base de múltiples experiments UV-Vis i RMN a temperatura i concentració variables, ha permès descobrir fins a tres tipus d'agregació i s'ha demostrat la complexa interrelació que existeix entre els diferents estats agregats.
El capítol 4 s’aprofundeix en la idea inicial, en el sentit que les oligoesquaramides cícliques podrien presentar activitat transfectiva, descrivint la síntesi de oligoesquaramides cícliques d'una a vuit unitats esquaramida (MC1-MC8). Els cromatogrames GPC proven la puresa dels oligómers MC1 a MC4, però al mateix temps han permès descobrir que els macrocicles superiors (MC5 a MC8) contenen proporcions variables d'altres oligómers i detectar la formació d'un material desconegut d'elevat pes molecular. L'avaluació de l'activitat transfectiva de la sèrie indica certa activitat transfectiva associada a MC7 i MC8. En cap cas s'observa toxicitat cel·lular ressenyable.
En el capítol 5, es planteja directament que polímers de base esquaramida podrien ser responsables de la transfecció. En aquest capítol es descriuen diversos procediments per a la síntesi de polímers de tipus poliaminoesquaramida (pASQUA) i la seva separació mitjançant precipitació fraccionada o mitjançant filtració centrífuga fraccional. S'ha caracteritzat el material i avaluat l'activitat biològica del material responsable de la transfecció.
El capítol 6 es troba en la interfase de la química i la biologia; on s'estudia la interacció pASQUA::ADN utilitzant plasmidis i altres àcids nucleics. Es descriuen imatges dels poliplexos obtingudes per AFM combinades amb mesures de potencial zeta i diàmetre hidrodinàmic. Tot això juntament amb els experiments de desplaçament d'indicadors fluorescents (FID) i sempre amb l'avaluació biològica ha demostrat l'elevada capacitat de transfecció dels polímers pASQUA.
Alguns experiments de transfecció sobre organismes unicel·lulars realitzats amb èxit amb pASQUA inclouen: protistos unicel·lulars (T. cruzi) formes epimastigot i amastigot. Monocercomonides (per als quals no existeix cap mètode efectiu de transfecció). Transformació extracelul·lar de bacteris (Mycobacterium tuberculosis).
Transformació intracel·lular de bacteris (Rickettsia canadensis i Orientia tsutsugamushi) en cèl·lules VERO. Transfeccions sobre línies cel·lulars immortalitzades (HEK293; PC-3; SW480) i cultius primaris.
- English
Gene therapy aims to treat diseases and disorders of genetic origin. A major extension in gene therapy is gene edition that is achieved using CRISPR/Cas9-type systems. In essence, both techniques are based on the insertion of exogenous genetic material at the cellular level to modify the corresponding protein expression. Although the potential for the development of gene therapies is enormous, there are significant drawbacks to the regular clinical use of gene therapies. Particularly important among these are the risks associated with biosecurity and the lack of effectiveness of treatments.
At the experimental level, the insertion of any type of DNA into cells requires the use of transfection vectors. Viral vectors are used for this purpose but, despite of their high effectiveness entail biological risks. As an alternative, chemical vectors (objective of this thesis) with lower biological risk but whose effectiveness is limited.
First, the reader is introduced to the structural characteristics of squaramides, their ability to interact with other molecules, and the applications that arise in various fields.
Experiments on a two-unit squaramide cyclic oligomer (MC2) are described in Chapter 3. Results obtained before the Thesis suggested that this compound could have transfective activity. Although the study performed afterward and included in this Thesis has ruled out having any transfective activity. The MC2 compound, from which its X-ray structure has been achieved, can present several conformations. This chapter describes the synthesis of a variant of MC2 soluble in non-polar solvents. The study, based on multiple UV-Vis and NMR experiments at variable temperature and concentration, has allowed to discover up to three types of aggregation and has demonstrated the complex interrelation that exists between the different aggregated states.
Chapter 4 enquires into the initial idea, that cyclic oligo-squaramides might possess transfection activity, describing the synthesis of macrocicles with one to eight squaramide units (MC1-MC8). GPC chromatograms proved the purity of MC1 to MC4 oligomers but at the same time have revealed that the upper macrocycles (MC5 to MC8) contain variable proportions of other oligomers and reveal, the formation of an unknown material of high molecular weight. The evaluation of the transfection activity in the series indicates some transfection activity associated with MC7 and MC8. Any of these macrocicles showed remarkable cell toxicity.
Chapter 5 directly states that squaramide-based polymers may be responsible for transfection. This chapter describes several procedures for the synthesis of polymers of the polyaminosquaramide type (pASQUA) and their separation by fractional precipitation or by centrifugal fractional filtration. The material has been characterised and the biological activity of the material responsible for the transfection has been evaluated.
Chapter 6 moves to the interface of chemistry and biology, were pASQUA::DNA interaction is studied using plasmids and other nucleic acids. We describe images of the polyplexes obtained by AFM combined with measurements of zeta potential and hydrodynamic diameter. All this together with the experiments of displacement of fluorescent indicators (FID) and always with the biological evaluation has shown the high capacity of transfection of the polymers pASQUA.
Some transfection experiments on single-celled organisms successfully performed with pASQUA include single-celled protists (T. cruzi) epimastigote and amastigote forms.
Monocercomonides (for which no effective transfection method exists). Extracellular transformation of bacteria (Mycobacterium tuberculosis). Intracellular transformation of bacteria (Rickettsia canadensis and Orientia tsutsugamushi) into VERO cells.
Transfections on cultured cell lines (HEK293; PC-3; SW480) and primary cultures
- español
