Resumen de New approaches to the study of mitochondrial ca2+ dynamics
INTRODUCCIÓN El calcio es un mensajero intracelular capaz de desencadenar señales intracelulares como la exocitosis, transcripción de determinados genes o incluso el inicio de la apoptosis a través de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial. ( Szabadkai et al., 2008; Pozzan et al., 2009;). Todos los tipos celulares poseen rutas de señalización en las que está implicado el calcio, aunque esta señalización es muy diversa espacial y temporalmente según el tipo celular. En respuesta a esta señalización, la concentración de calcio en el citosol va a aumentar desde concentraciones de 0,1 ¿ 0,2¿M en situación de reposo, hasta 0,5 - 3¿M en respuesta a un estímulo.
La mitocondria juega un papel fundamental en la regulación de la señalización intracelular por calcio. Cuando después de un estímulo la concentración de calcio citosólico aumenta, la mitocondria es capaz de captar y acumular grandes cantidades de calcio en su interior (Arnaudeau et al., 2001, Montero et al., 2002,), llegando incluso a concentraciones de 1- 2mM, regulando y modulando esta señal espacial y temporalmente. Esta regulación se da a nivel global del citosol y en los microdominios de alto calcio que se producen en la boca de los canales de calcio de la membrana plasmática y retículo endoplásmico ( Rizzuto et al., 2000). Las mitocondrias cercanas al retículo endoplásmico son capaces de retirar el exceso de calcio, evitando que el propio calcio inhiba el receptor de IP3 y permitiendo que la señal pueda continuar.
RESULTADOS DE LA TESIS DOCTORAL En cuanto a los resultados obtenidos cabe destacar los siguientes: Realización de una comparativa detallada de varios métodos de medida de calcio mitocondrial como el colorante fluorescente rhod-2, la proteína fluorescente pericam y la proteína bioluminiscente aequorina. En este apartado comprobamos que el colorante fluorescente rhod-2 no es capaz de monitorizar adecuadamente cambios en la concentración de calcio mitocondrial, ya sea en células intactas o en células permeabilizadas. En respuesta a dos estímulos de histamina sucesivos o frente a dos adiciones de calcio 10¿M sucesivas el rhod-2 no modifica su intensidad de fluorescencia durante el segundo incremento de calcio mitocondrial. Sin embargo, tanto la aequorina como el pericam si que registran este segundo incremento sin ningún problema. Cabe añadir que la carga del rhod-2 causa una granulación de la red mitocondrial, pudiendo afectar a la respuesta celular.
Por otra parte se empleó un colorante de baja afinidad rhod-5N para realizar también medidas de calcio mitocondrial. Se calibró in situ este colorante obteniendo una Kd de 470¿M, ideal para medir en el rango de concentraciones de calcio mitocondrial. Las medidas de fluorescencia realizadas con este colorante se transformaron mediante la recta de calibración en datos de concentración de calcio libre, obteniéndose valores muy similares a los obtenidos anteriormente con aequorina. Así mismo este colorante nos permitió realizar medidas de calcio a nivel subcelular, distinguiendo dos poblaciones mitocondriales diferenciadas, atendiendo a su nivel de acumulación de calcio.
Otro de los resultados a destacar fue la obtención con éxito de una nueva mutación en la proteína aequorina, con el fin de disminuir la afinidad de dicha proteína por el calcio, evitando así el consumo de la sonda durante los experimentos. Gracias a esta nueva aequorina doblemente mutada, ahora somos capaces de medir cantidades elevadas de calcio durante periodos prolongados de tiempo. Mediante esta nueva aequorina pudimos estudiar la dependencia de la concentración de calcio mitocondrial en función del fosfato presente en el medio. Se observó que aunque la presencia de fosfato disminuye la cantidad de calcio libre en el interior de la mitocondria, éste puede alcanzar niveles que están dentro del rango milimolar, y mantenerse estable en dicho nivel durante periodos prolongados de tiempo.
Por último se estudiaron los flujos de entrada y salida de la mitocondria a través del uniportador de calcio mitocondrial, el intercambiador calcio protones y el intercambiador sodio calcio. Se demostró que salida de calcio a través del intercambiador sodio calcio juega un papel fundamental en la extrusión de calcio de la mitocondria, siendo este mecanismo de vital importancia, sobre todo en presencia de alto calcio en el interior mitocondria. Además se pudieron estudiar en detalle y por separado las cinéticas de entrada y salida de la mitocondria en presencia de diferentes concentraciones de sodio. La ausencia total de sodio nos permitió estudiar también en detalle la salida de calcio a través del intercambiador calcio protones.
BIBLIOGRAFIA G. Szabadkai, M. R. Duchen. Mitochondria: The Hub of Cellular Ca2+ Signaling. Physiology 23 (2008) 84¿94.
T. Pozzan, R. Rudolf, Measurements of mitochondrial calcium in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1787 2009)1317-1323.
S. Arnaudeau, W.L. Kelley, J.V.Jr Walsh, N. Demaurex, Mitochondria recycle Ca2+ to the endoplasmic reticulum and prevent the depletion of neighboring endoplasmic reticulum regions, J. Biol. Chem. 276 (2001) 29430-29439.
M. Montero, C.D. Lobatón, A. Moreno, J. Alvarez, A novel regulatory mechanism of the mitochondrial Ca2+ uniporter revealed by the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB202190, FASEB J. 16 (2002) 1955-1957.
R. Rizzuto, P. Bernardi y T. Pozzan,. Mitochondria as all-round players of the calcium game. JPhysiol. 529 (2000) 37- 47
