Resumen de Mecanismos de regresión y activación testicular en mamíferos con reproducción estacional: control genético y susceptibilidad a cambios ambientales
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RESUMEN La reproducción estacional es la que se produce de forma discontinua a lo largo del año como resultado de la adaptación a las fluctuaciones ambientales resultante de las estaciones climáticas. Este comportamiento lo presentan numerosas especies de vertebrados que habitan en regiones templadas de la Tierra, concentrando así su esfuerzo reproductivo en aquellas estaciones del año que ofrecen mejores condiciones ambientales y garantizando que la descendencia nazca y crezca en los periodos más favorables. Las especies con reproducción estacional son capaces de detener y reanudar la gametogénesis de forma cíclica. Tanto los machos como las hembras experimentan cambios sustanciales en sus gónadas durante la transición entre los períodos reproductivos y no reproductivos. En los machos tiene lugar un proceso de regresión testicular que implica cambios importantes en la función testicular, viéndose alteradas la espermatogénesis, la androgénesis y el sistema inmunológico local. La mayor parte de los estudios realizados hasta el momento son incompletos pues sólo enfocan aspectos muy particulares de proceso en muchos casos (apoptosis, variaciones hormonales, ultraestructura, cambios morfológicos, dinámica de las moléculas de adhesión celular). Estudios completos que incluyan todas estas características sólo se han llevado a cabo en un número reducido de especies, como el topo ibérico, el armadillo de pelo largo y topillo mediterráno.
En la presente tesis doctoral, hemos realizado un estudio completo del proceso de regresión testicular en una nueva especie, el erizo orejudo, Hemiechinus auritus con individuos procedentes del norte de Egipto. Nuestros resultados muestran que en esta especie el principal efector de regresión testicular es la descamación de las células germinales, como se ha descrito previamente tanto en el topo ibérico Talpa occidentalis como en el gran armadillo peludo C. villosus. La presencia de abundantes espermatocitos primarios en el lumen, tanto de los túbulos seminíferos como de los epidídimos, indica que las células meióticas inmaduras se desprenden precozmente del epitelio seminífero. Posteriormente, estas células germinales que se han desprendido son eliminadas a través de la sección distal del tracto genito-urinario. Además encontramos que la apoptosis no es la causa principal de la pérdida de células germinales en el testículo en regresión de H. auritus, ya que hay un número muy reducido de células apoptóticas en dichos testículos. Sin embargo, la apoptosis sí juega un papel importante en los testículos inactivos, ya que es el principal mecanismo que elimina los espermatocitos primarios que alcanzan el estadio de paquitene. Por otro lado, hemos encontrado que la expresión de moléculas de adhesión celular está alterada tanto en el epitelio germinativo de los testículos en regresión como los inactivos, sugiriendo que la adhesión entre células de Sertoli y entre las células de Sertoli y las células germinales está comprometida en los testículos en regresión, explicando así el desprendimiento de células germinales que tiene lugar durante este periodo. Finalmente, al igual que ocurre en todas las especies estudiadas hasta la fecha, los niveles de testosterona circulantes están reducidos en los individuos inactivos de H. auritus, indicando que la reducción de la concentración de andrógenos es probablemente la señal hormonal que induce la eliminación estacional de las células germinales y la pérdida de la adhesión celular en el epitelio germinativo de mamíferos.
A partir de los diferentes trabajos realizados en mamíferos, como el realizado en la presente tesis doctoral, en los que se estudian los cambios que los testículos sufren durante su ciclo reproductivo anual se extrae la conclusión de que es evidente que no existe un mecanismo único de regresión testicular. Actualmente se han identificado dos procesos celulares principales por los que se eliminan masivamente las células germinales durante el proceso de regresión testicular: la apoptosis y la descamación de células germinales. A pesar de ello, el control genético de estos cambios testiculares es poco conocido, principalmente por la complejidad de las rutas genéticas que operan en un tipo celular específico de testículo y la señalización cruzada entre los diferentes tipos celulares. En este sentido, los estudios de perfiles de expresión pueden proporcionar una visión integrada de las rutas moleculares interactivas que operan en el testículo, y también pueden darnos información sobre cuáles de ellas están afectadas en los testículos con regresión. En la presente tesis doctoral hemos analizado el transcriptoma testicular de dos especies para las que previamente habíamos realizado un estudio histológico, inmunohistológico, funcional y hormonal de los cambios testiculares a lo largo de su ciclo reproductivo, el topillo mediterráneo, Microtus duodecimcostatus y el topo ibérico Talpa occidentalis.
Para M. duodecimcostatus hemos encontrado que las rutas de señalización MAPK/ERK1/2, WNT, TGF-Beta, Ca2+ citosólico y PI3K están desreguladas en el testículo inactivo. Todas estas rutas operan en las células de Sertoli y están implicadas en la regulación de la espermatogénesis y en la dinámica de las uniones estrechas y adherentes presentes en la barrera hemato-testicular (BTB). Nuestro análisis demostró que MAPK/ERK1/2, una ruta de señalización necesaria para la proliferación celular mitótica y meiótica, desempeña un papel central en este proceso. Estudios anteriores han demostrado que la testosterona modula la actividad de la ruta de señalización MAPK/ERK en las células de Sertoli, indicando que la disminución de los niveles séricos de testosterona en los machos inactivos de M. duodecimcostatus afecta a la regulación por parte de las células de Sertoli de varias rutas moleculares interconectadas que inducen: a) alteraciones del ciclo espermatogénico, b) desregulación de las moléculas de adhesión célular y c) alteración de la dinámica de la BTB.
El testículo está sometido a un entorno inmunológico especial conocido como “inmuno-privilegio” que protege a las células germinales de un ataque autoinmune. Este “inmuno-privilegio” se basa en: a) la formación de la BTB en el epitelio germinativo, b) la capacidad disminuida de la población de macrófagos testiculares para inducir una respuesta inflamatoria y c) la expresión constitutiva de citoquinas antiinflamatorias por parte de las células inmunitarias y otras células somáticas. Nuestro análisis transcriptómico indicó que la población de macrófagos estaba activada en el testículo inactivo de M. duodecimcostatus. Estudios previos han mostrado que la testosterona es esencial para mantener el “inmuno-privilegio” testicular en condiciones fisiológicas, por lo que podemos concluir que los niveles reducidos de testosterona en los testículos inactivos de M. duodecimcostatus pueden inducir la secreción de citoquinas pro-inflamatorias por parte de los macrófagos y, probablemente, por otros tipos de células somáticas (por ejemplo, Sertoli y células mioides peritubulares) que activan a los macrófagos.
Resulta interesante que el estudio transcriptómico de los testículos de T. occidentalis también reveló que procesos biológicos como la adhesión celular y el ensamblaje de las uniones celulares, así como varias rutas moleculares, incluyendo MAPK, ERK1/2, TGF-Beta, Ca2+ citosólico, PI3K, GTPasa y TNF estaban alteradas en los testículos inactivos. Por otro lado, el análisis transcriptómico también reveló que el sistema inmunitario se activaba en los testículos inactivos de T. occidentalis. Teniendo en cuenta todas estas observaciones, sugerimos que, como ocurre en M. duodecimcostatus, los bajos niveles de testosterona en los testículos inactivos de T. occidentalis conducen a la pérdida del “inmuno-privilegio” del testículo activo, hecho que se manifiesta por la permeabilidad de la BTB y el aumento de la producción de citoquinas por parte de la población de macrófagos (y quizás de otras células somáticas). En conjunto, todos estos procesos podrían contribuir a mantener el estado de quiescencia de las gónadas de los topos durante el periodo no reproductivo. En T. occidentalis también analizamos los niveles de expresión de genes pertenecientes a la “firma de expresión génica” de grupos espermatogénicos tempranos y descubrimos que varios procesos biológicos están alterados en los testículos inactivos del topo ibérico, en particular la ubiquitinación de proteínas en la etapa de espermatogonia. Sin embargo, es difícil saber si esta alteración en los perfiles de expresión se debe al entorno testicular de los testículos quiescentes, en el que tanto la BTB como la función de adhesión celular están comprometidos, o a mecanismos actualmente desconocidos que afectan directamente a la expresión de las células germinales, o a ambos.
Por último, hemos comparado los datos de los tanscriptomas del topo con los del topillo mediterráneo. Encontramos un gran número de genes que están desregulados en los testículos inactivos de ambas especies, con dos coincidencias notables: 1) muchos de estos genes están implicados en el control de la adhesión celular y, de acuerdo con esto, se desregulan rutas moleculares como MAPK, ERK1/2, TGF-Beta, GTPasa y TNF, que controlan las uniones celulares en el epitelio germinativo y 2) también encontramos un conjunto compartido de genes implicados en la regulación de la respuesta inmune. Estas coincidencias son relevantes si tenemos en cuenta que los testículos inactivos de estas dos especies no presentan características idénticas. Por ejemplo, la iniciación de la meiosis por parte de las espermatogonias está completamente abolida en los testículos inactivos de M. duodecimcostatus, pero no en los de T. occidentalis, donde las células germinales entran en meiosis y la espermatogénesis progresa hasta los primeros estadíos de espermatocitos primarios. Además, los túbulos seminíferos inactivos de M. duodecimcostatus permanecen adyacentes entre sí, mientras que los de T. occidentalis se separan ampliamente por la interposición de las células de Leydig. A pesar de estas diferencias, aquí hemos encontrado que dos importantes funciones testiculares, la adhesión celular y la respuesta inmune, están desreguladas en los testículos inactivos de estas dos especies, lo que sugiere que existen mecanismos moleculares conservados asociados a la involución testicular estacional en los mamíferos. Por lo tanto, deberían realizarse estudios similares en otras especies para comprobar esta hipótesis.
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ABSTRACT Seasonal reproduction is the reproduction that occurs discontinuously throughout the year as a result of adaptation to environmental fluctuations resulting from climatic seasons. This behaviour is exhibited by numerous vertebrate species inhabiting temperate regions of the Earth, thus concentrating their reproductive effort in those seasons of the year that offer the best environmental conditions and ensuring that the offspring born and grow in the most favourable periods. Species with seasonally reproduction are able to stop and resume gametogenesis cyclically. Both males and females undergo substantial changes in their gonads during the transition between reproductive and non-reproductive periods. In males, a process of testicular regression takes place which involves major changes in testicular function, altering spermatogenesis, androgenesis and the local immune system. Most of the studies to date are incomplete due to they only focus on very particular aspects of the process in many cases (apoptosis, hormonal variations, ultrastructure, morphological changes, dynamics of cell adhesion molecules). Complete studies including all these features have only been carried out on a small number of species, such as the Iberian mole, the large hairy armadillo and the Mediterranean vole.
In the present PhD thesis, we have carried out a comprehensive study of the process of testicular regression in a new species, the longeared hedgehog, Hemiechinus auritus captured from northern Egypt. Our results show that germ cell desquamation is the main effector of testicular regression in this species, as previously described in two studies in the Iberian mole Talpa occidentalis and the large hairy armadillo C. villosus. The presence of abundant primary spermatocytes in the lumen of seminiferous tubules and epididymis indicates that immature meiotic cells detach early from the seminiferous epithelium. Subsequently, these detached germ cells are eliminated via the distal section of the genito- urinary tract. In addition we found that apoptosis is not the main cause of germ cell loss in the regressing testis of H. auritus, as very small numbers of apoptotic cells are present in these testes. However, apoptosis has an important role in the quiescent testis, because it is the main mechanism that eliminates primary spermatocytes that reach the pachytene stage. On the other hand, we have found that the expression of cell adhesión molecules is altered in both the germinal epithelium of regressing and inactive testes, suggesting that Sertoli cell-cell adhesion and Sertoli cellgerm cell adhesion is compromised in regressing testes, thus explaining the germ cell detachment that occurs during this period. Finally, as happens in all species studied to date, circulating testosterone levels are reduced in reproductively inactive H. auritus individuals, indicating that reduced androgen concentration is probably the hormonal signal that induces seasonal germ cell depletion and loss of cell adhesion in the mammalian germ cell epithelium.
From the different studies carried out in mammals, including the present one, it is clear that there is not a unique mechanism of testis regression. Two main cellular processes by which germ cells are massively depleted during the process of testicular regression have now been identified: apoptosis and germ cell desquamation. Despite this, the genetic control of these testicular changes is poorly understood, mainly because of the complexity of the genetic pathways operating in a specific testicular cell type and the cross-signalling between different cell types. In this sense, expression profiling studies can provide an integrated view of the interacting molecular pathways that act on the testis, and can also give us information on which of them are affected in the regressing testis. In this PhD thesis we have analysed the testicular transcriptome of two species in which we had previously carried out histological, immunohistological, functional and hormonal studies throughout their reproductive cycle: the Mediterranean vole, Microtus duodecimcostatus, and the Iberian vole, T. occidentalis.
In M. duodecimcostatus, we found that MAPK/ERK1/2, WNT, TGF-Beta , cytosolic Ca2+ and PI3K signalling pathways are downregulated in the inactive testis. All these pathways operate in Sertoli cells and are involved in the regulation of spermatogenesis and in the dynamics of tight and adherens junctions present in the BTB. Our analysis demonstrated that MAPK/ERK1/2, a signalling pathway required for mitotic and meiotic cell proliferation, plays a central role in this process. Previous studies have shown that testosterone modulates the activity of the MAPK/ERK signalling pathway in Sertoli cells, indicating that decreased serum testosterone levels in inactive M. duodecimcostatus males affect Sertoli cell regulation of several interconnected molecular pathways leading to: a) alterations in the spermatogenic cycle, b) deregulation of cell adhesion molecules and c) alteration of BTB dynamics.
The testis is subjected to a special immunological environment, known as the immuno-privilege, that protects the germ cells from autoinmune response. This immuno-privilege is based on: a) the formation of BTB in the germinal epithelium, b) the decreased ability of the testicular macrophage population to induce an inflammatory response and c) the constitutive expression of anti-inflammatory cytokines by immune and somatic cells. Our transcriptomic analysis indicated that the macrophage population was activated in the inactive testis of M. duodecimcostatus. Previous studies have shown that testosterone is essential to maintaining testicular immuno-privilege under physiological conditions, so we can conclude that reduced testosterone levels in the inactive testis of M. duodecimcostatus may induce the secretion of pro-inflammatory cytokines by macrophages and, probably, by other somatic cell types (e.g. Sertoli and peritubular myoid cells) that activate macrophages. Interestingly, transcriptomic study of T. occidentalis testis also revealed that biological processes such as cell adhesion and cell junction assembly, as well as several molecular pathways, including MAPK, ERK1/2, TGF-Beta , cytosolic Ca2+, PI3K, GTPase and TNF were altered in the quiescent testis. On the other hand, transcriptomic analysis also revealed that the immune system was activated in the inactive testis of T. occidentalis. According to all these observations, we suggest that, as in M. duodecimcostatus, low testosterone levels in the inactive testis of T. occidentalis lead to the loss of the immunoprivilege operating in the active testis, as manifested by permeability of the BTB and increased cytokine production by the macrophage population (and perhaps other somatic cell). Definitely, all of these processes could contribute to the maintenance the quiescent state of the mole gonads during the non-reproductive period.
In T. occidentalis we also analysed the expression levels of genes belonging to the gene expression profile of early spermatogenic clusters and found that several biological processes are altered in inactive testes, in particular the protein ubiquitination at the spermatogonia stage. However, it is difficult to know if this alteration in expression profiles is due to the testicular environment of the quiescent testis, in which both BTB and cell adhesion function are compromised, or to currently unknown mechanisms directly affecting germ cell expression, or both.
Finally, we compared the tanscriptomic data of both the Iberian mole and the Mediterranean pine vole. We found a large number of genes that are deregulated in the inactive testes of both species, and found two notable coincidences: 1) many of these genes are involved in the control of cell adhesion, including those involved in molecular pathways such as MAPK, ERK1/2, TGF-Beta , GTPase and TNF, which control cell junctions in the germinative epithelium, and 2) we also found a shared set of genes involved in the regulation of the immune response. These overlaps are relevant because the inactive testes of these two species do not have identical features. For example, the initiation of meiosis by spermatogonia is completely abolished in the inactive testes of M. duodecimcostatus, but not in those of T. occidentalis, where spermatogonia continue enterig meiosis and spermatogenesis progresses to zygotene-pachytene. In addition, the quiescent seminiferous tubules of M. duodecimcostatus remain adjacent to each other, whereas those of T. occidentalis are widely separated by Leydig cell intervention. Despite these differences, here we have found that two important testicular functions, cell adhesion and immune response, are dysregulated in the inactive testes of these two species, suggesting that there are conserved molecular mechanisms associated with seasonal testicular involution in mammals. Therefore, similar studies should be conducted in other species to test this hypothesis.
