Identificación de nuevos factores endocrinos-metabólicos y de la maquinaria de splicing con potencial diagnóstico, pronóstico y/o terapéutico en cáncer de próstata
- Autores: Juan Manuel Jiménez Vacas
- Directores de la Tesis: Rául Miguel Luque Huertas (dir. tes.), Manuel D. Gahete (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 2020
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Eduardo Munoz Blanco (presid.), David Olmos Hidalgo (secret.), Riccarda Granata (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina por la Universidad de Córdoba
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Helvia
- Resumen
1. introducción o motivación de la tesis El Cáncer de Próstata (CaP) es la patología tumoral con mayor incidencia en hombres en países desarrollados y representa una de las principales causas de mortalidad relacionadas con cáncer en este colectivo (1). A pesar de los avances que se han producido durante los últimos años en el campo del diagnóstico y el tratamiento del CaP, la realidad es que tanto las herramientas diagnósticas como las alternativas terapéuticas que existen actualmente no son todo lo eficientes que se desearía. En concreto, el antígeno prostático específico (PSA) representa el actual “gold standard” para el cribado del CaP. Lamentablemente, la prueba del PSA presenta una especificidad discutible, ya que ciertas condiciones fisiológicas o patologías no tumorales (p.ej. hiperplasia benigna de próstata, prostatitis) también se asocian a niveles circulantes de PSA elevados (2, 3). Además, la capacidad diagnóstica y la utilidad clínica de la prueba del PSA es especialmente baja en pacientes con niveles de PSA entre 3-10 ng/mL (la conocida como zona gris del PSA) (4). Por estos motivos, la prueba del PSA está asociada al sobrediagnóstico de CaP, y, en consecuencia, a la realización de biopsias innecesarias (5). Además, este procedimiento invasivo puede provocar efectos secundarios como dolor, sangrado e infecciones, disminuyendo significativamente la calidad de vida de los pacientes (6). Por tanto, es necesaria la búsqueda e identificación de nuevas herramientas diagnósticas que complementen o reemplacen al PSA en la práctica clínica. Lo mismo ocurre en el caso de las alternativas terapéuticas, ya que son muy limitadas. En concreto, el tratamiento farmacológico usado como primera opción para el tratamiento de CaP en estadio avanzado o recidivas tumorales consiste en la deprivación androgénica (p.ej. antagonistas de LHRH, abiraterona), debido a la marcada dependencia de la señalización androgénica que presenta el CaP (7, 8). Sin embargo, alrededor del 80% de los pacientes tratados con deprivación androgénica desarrollan resistencia frente a este tratamiento, generándose lo que se conoce como CaP resistente a la castración (CPRC), el fenotipo más agresivo de esta enfermedad, el cuál sigue siendo letal en la actualidad (9). Por ello, la búsqueda de dianas terapéuticas alternativas que puedan ser útiles para el desarrollo de nuevos tratamientos más eficientes que los actuales sigue siendo uno de los principales objetivos de la comunidad científica biomédica.
El CaP se desarrolla principalmente en pacientes de elevada edad, que padecen, con una elevada frecuencia, patologías endocrino-metabólicas (p.ej. obesidad, diabetes), las cuales pueden influenciar el desarrollo y/o la progresión del CaP, aumentando la complejidad de esta patología (10). En concreto, la obesidad se asocia a un mayor riesgo de desarrollar CaP, además de aumentar su agresividad (11). En este sentido, se ha descrito que la metformina y las estatinas (drogas comúnmente usadas en pacientes con patologías endocrino-metabólicas como obesidad o diabetes) ejercen efectos antitumorales en numerosos tipos tumorales, tanto in vitro como in vivo (12-15). Sin embargo, aunque la combinación de ambas drogas ha demostrado ejercer un papel antitumoral aditivo en algunos tipos de células tumorales (16, 17), hasta el momento, esta observación no se ha estudiado en profundidad en el caso del CaP.
Una limitación importante en este campo es que la información disponible sobre los posibles mecanismos moleculares concretos que subyacen la interacción fisiopatológica entre la obesidad y el CaP es muy limitada e incompleta. En este sentido, se conoce que numerosos componentes de diferentes sistemas hormonales (ej. andrógenos, ghrelina, etc.) se encuentran claramente desregulados en CaP y obesidad, pudiendo constituir una fuente de biomarcadores en estas patologías (18-20). El sistema ghrelina en un ejemplo claro en este contexto, puesto que es un sistema hormonal pleiotrópico formado por varios ligandos (p.ej. Ghrelina, In1-ghrelina), enzimas (GOAT) y receptores (GHSR1a, GHSR1b) (21). Así, la In1-ghrelina (variante de splicing alternativo que se forma a partir de la retención del intrón-1) se encuentra sobreexpresada y juega un papel oncogénico en el CaP (19). De la misma forma, los niveles de GOAT son más elevados en tejidos de CaP con respecto a aquellos de próstata no tumoral, aunque se desconoce hasta el momento el posible papel fisiopatológico de esta enzima en CaP (20). Además, se ha reportado que tanto los niveles circulantes de In1-ghrelina como los de GOAT se encuentran más elevados en pacientes con CaP que en individuos sanos (19, 22), lo que sugiere que ambos elementos podrían representar biomarcadores de diagnóstico no invasivo del CaP. Sin embargo, hasta el momento, se desconoce si In1-ghrelina o GOAT pueden ser detectadas en orina y si también están desreguladas en este fluido (que constituye una fuente enriquecida de proteínas derivadas de la próstata) en pacientes con CaP respecto a pacientes sin CaP.
Finalmente, es importante mencionar que la alteración del proceso de splicing, un mecanismo fisiológico involucrado en la maduración de los pre-ARNm y que puede generar varios ARNm maduros a partir de un solo gen, lo que aumenta la complejidad transcriptómica de las células eucariotas, se ha erigido como una característica común de un gran número de patologías tumorales, incluyendo el CaP (23, 24). De hecho, se ha demostrado la existencia de variantes de splicing con potencial oncogénico, asociadas al desarrollo, progresión y/o resistencia a tratamientos de múltiples patológicas tumorales, así como el CaP (24, 25). Estas desregulaciones del proceso de splicing pueden deberse a una alteración de la maquinaria que lleva a cabo este proceso celular (espliceosoma), así como de las proteínas que interactúan con la misma regulando este mecanismo (factores de splicing) (23), por lo que podrían jugar un papel relevante en el desarrollo y/o progresión del CaP. Así, aunque ciertos estudios han mostrado la desregulación concreta de algunos de estos elementos, no se ha explorado aún de manera sistemática la desregulación de esta maquinaria y su posible implicación en el desarrollo y/o progresión del CaP.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, el objetivo de esta Tesis Doctoral fue determinar el papel que ejercen ciertos elementos reguladores del mecanismo de splicing (componentes del espliceosoma y factores de splicing) y moduladores metabólicos (tanto elementos endógenos como tratamientos exógenos) en el desarrollo, progresión y/o agresividad del CaP, con el fin de descubrir nuevos biomarcadores (diagnósticos y/o pronósticos) y herramientas diagnósticas que pudieran mejorar el diagnóstico, tratamiento y manejo clínico de los pacientes con CaP.
2.contenido de la investigación La primera sección de esta Tesis Doctoral se centró en estudiar la posible desregulación de la maquinaria de splicing en CaP, así como sus consecuencias clínicas y funcionales en esta patología tumoral. Los resultados generados indican que la maquinaria de splicing se encuentra profundamente desregulada en CaP, incluyendo elementos clave de esta maquinaria como son SNRNP200, SRRM1, SRSF3, RBM22 o SF3B1. De entre todos los componentes del espliceosoma y factores de splicing desregulados, SNRNP200, SRRM1 y SRSF3 se seleccionaron inicialmente para llevar a cabo análisis más profundos puesto que se encontraban asociados con todos los parámetros clínicos de agresividad disponibles en nuestra cohorte de pacientes. El silenciamiento de SNRNP200, SRRM1 o SRSF3 produjo una inhibición de rutas de señalización oncogénicas y alteró el patrón de splicing de genes relacionados con el aumento de agresividad tumoral del CaP y/o con el desarrollo de CPRC. Además, el silenciamiento de SNRNP200, SRRM1 y de SRSF3 sensibilizó a células de CPRC frente al tratamiento con un inhibidor del receptor de andrógenos (AR; Abiraterona). Por tanto, estos datos demuestran que SNRNP200, SRRM1 y SRSF3 podrían representar nuevos biomarcadores de diagnóstico y pronóstico, así como dianas terapéuticas en CaP y CPRC.
Esta Tesis Doctoral también se centró en el estudio de la posible desregulación y papel fisiopatológico en CaP de RBM22, un factor de splicing involucrado en la activación del espliceosoma. En concreto, se encontró que los niveles de RBM22 eran más bajos (a nivel del ARNm y proteína) en tejidos de CaP comparados con los tejidos derivados de próstata no tumoral, y que dichos niveles se asociaron inversamente con parámetros clínicos de agresividad tumoral en pacientes y en un modelo preclínico. Asimismo, se observó que la sobreexpresión de RBM22 disminuyó las características de agresividad de células de CaP tanto in vitro como in vivo (ej. crecimiento tumoral, proliferación, migración, etc.). Desde un punto de vista molecular, la aplicación de técnicas de análisis a gran escala (RNAseq, CLIP-seq y array de señalización) sobre muestras de CaP in vitro e in vivo mostró la inhibición de MYC, MYCN y proteínas E2F, así como una profunda desregulación del proceso de splicing como los mecanismos moleculares principales asociados a los descubrimientos previos observados en respuesta a la sobreexpresión de RBM22 en CaP. Por tanto, estos resultados sugieren que RBM22 juega un papel antitumoral relevante en CaP mediante la modulación del proceso de splicing y la reducción de los niveles/actividad de MYC, MYCN y E2F.
En el caso del análisis de SF3B1, un elemento clave para el correcto ensamblaje del espliceosoma, se observó que se encontraba sobreexpresado en CaP y que sus niveles estaban directamente asociados con parámetros de agresividad del CaP. Asimismo, tanto el silenciamiento de SF3B1 como el bloqueo de su actividad (mediante el uso del inhibidor selectivo pladienolide-B) resultó en una reducción de numerosos parámetros funcionales de agresividad tumorales y en un aumento de la tasa apoptótica en células de CaP. Desde el punto de vista molecular, la inhibición de SF3B1 alteró rutas de señalización oncogénicas como PI3K/AKT o JNK, disminuyó los niveles de variantes de splicing oncogénicas (AR-v7 e In1-ghrelina), y desreguló profundamente el patrón de expresión de numerosos elementos involucrados en procesos de metabolismo de ARN [splicing y degradación del ARNm mediada por mutaciones terminadoras (NMD)]. El conjunto de estos resultados indica que SF3B1 podría representar un nuevo biomarcador pronóstico, así como una diana terapéutica de CaP, lo que sugiere una posible utilidad del pladienolide-B para el tratamiento de esta devastadora patología.
Una vez que demostramos el importante papel que ejercen numerosos elementos involucrados en la regulación del proceso de splicing en CaP, y puesto que se ha demostrado previamente que la metformina ejerce efectos antitumorales en diversos tipos de cáncer y que altera la expresión de factores de splicing concretos en células de distinta naturaleza, decidimos explorar la posible implicación que podría tener la desregulación del splicing en los efectos antitumorales mediados por la metformina en CaP. Los datos generados indican que la metformina provoca una profunda desregulación del patrón de expresión de numerosos componentes del espliceosoma, así como factores de splicing en células de CaP, siendo algunos de estos resultados (ej. disminución de la expresión de SF3B1, SRRM1 y NOVA1) validados también in vivo en un modelo xenógrafo de CaP. Además, el efecto antiproliferativo de la metformina se bloqueó por completo tras el silenciamiento de la expresión de SF3B1, SRRM1 y NOVA1 en células de CaP. Por tanto, estos resultados sugieren que la desregulación de algunos de los componentes de la maquinaria de splicing, especialmente SF3B1, SRRM1 y de NOVA1, puede representar un mecanismo molecular subyacente a los efectos antitumorales conocidos de la metformina en CaP.
La segunda sección de esta Tesis se centró en el análisis de las acciones antitumorales de la metformina, estatinas y su combinación en CaP, así como de los mecanismos moleculares asociados. En concreto, se observó que el tratamiento combinado con metformina y estatinas se asoció a efectos más beneficiosos sobre parámetros clínicos de agresividad en pacientes con CaP con respecto a pacientes que recibieron estas terapias farmacológicas de manera individual. De igual manera, aunque el tratamiento con biguanidas y estatinas, por separado, redujo la agresividad de células de CaP in vitro, estos efectos antitumorales fueron más pronunciados cuando estos tratamientos se dieron en combinación. Desde un punto de vista molecular, se observó que el tratamiento con metformina y simvastatina en combinación produjo una hiper-inactivación de AR y mTOR, además de aumentar la expresión de inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas (CKIs; CDKN1A, CDKN1B, CDKN2A y CDKN2D), siendo algunos de estos cambios validados en muestras derivadas de pacientes con CaP (ej. aumento de la expresión de CDKN1B y de CDKN2A). Los resultados derivados de este estudio demuestran que la metformina y la simvastatina llevan a cabo efectos antitumorales aditivos en CaP, sugiriendo que esta combinación podría representar una nueva y atractiva aproximación terapéutica para combatir el CaP.
Finalmente, en la tercera sección de esta Tesis Doctoral, se analizaron componentes específicos pertenecientes al sistema ghrelina (concretamente la enzima GOAT y la variante In1-ghrelina) parar determinar su posible papel como herramientas diagnósticas, pronósticas y/o terapéuticas en CaP. Estos resultados mostraron que la GOAT podía ser detectada en muestras de orina, en donde sus niveles eran capaces de mejorar la capacidad diagnóstica del PSA plasmático, especialmente para detectar CaP significativo (definido como Gleason score ≥7), en pacientes con PSA en zona gris. Además, niveles elevados de GOAT en orina se asociaron a un aumento de riesgo de desarrollar CaP y CaP significativo, y se correlacionaron positivamente con parámetros clínicos y moleculares claves de agresividad en pacientes con CaP. Asimismo, también se demostró que la sobreexpresión de GOAT aumentó la agresividad del CaP tanto in vitro como in vivo, mientras que su silenciamiento o su bloqueo de su actividad (mediante el uso de un inhibidor de GOAT específico) disminuyó significativamente parámetros funcionales de agresividad en células de CaP in vitro. Por tanto, estos resultados demuestran que la enzima GOAT puede representar un biomarcador de diagnóstico no invasivo de CaP adicional, así como una posible herramienta pronóstica y terapéutica de CaP. Además, el análisis de In1-ghrelina en orina de pacientes con PSA en la zona gris, indicaron que sus niveles eran capaces de discriminar entre pacientes con y sin CaP, que se asociaron a un mayor riesgo de CaP, obesidad y diabetes, y se correlacionaron con parámetros metabólicos y de agresividad tumoral. De hecho, se observó que la capacidad diagnóstica de los niveles de In1-ghrelina en orina fue especialmente elevada cuando se analizaron pacientes obesos, lo que sugiere que la In1-ghrelina podría representar un nuevo y más personalizado biomarcador de diagnóstico no invasivo en CaP.
3.Conclusión Teniendo en cuenta todos los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral, la conclusión general es que la alteración del splicing y la desregulación de ciertos elementos endocrino-metabólicos podría contribuir en el desarrollo, progresión y/o agresividad del CaP, representando una fuente de biomarcadores de diagnóstico y pronóstico, así como dianas terapéuticas novedosas, que podrían ser explotadas para mejorar el diagnóstico de pacientes con CaP, así como para desarrollar herramientas pronosticas y terapéuticas efectivas para combatir esta devastadora patología.
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