Caracterización de nuevas rutas reguladoras del metabolismo lipídico en adipocitos. Alteraciones en obesidad
- Autores: Alejandro Fernández Vega
- Directores de la Tesis: Rocío Guzmán Ruiz (dir. tes.), María M. Malagón Poyato (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 2020
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: J. Antonio Bárcena Ruiz (presid.), Cristina Andrés Lacueva (secret.), Nicolas Vitale (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina por la Universidad de Córdoba
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: Helvia
- Resumen
1. Introducción o motivación de la tesis La obesidad es una enfermedad multifactorial en la que intervienen tanto factores genéticos como socio-ambientales que incluyen cambios en la pauta de alimentación y actividad física. Actualmente se estima que casi el 40% de la población tiene sobrepeso u obesidad (Chooi et al., 2019). Además, esta patología representa un factor de riesgo importante para el desarrollo de otras comorbilidades o complicaciones como enfermedad cardiovascular, diabetes tipo 2, dislipemia o incluso cáncer (Amoretti et al., 2002; Czernichow et al., 2011; Singh et al., 2013). También está asociada con una disminución de la calidad de vida y según el grado de severidad y sus comorbilidades, con una reducción en la esperanza de vida de 5 a 20 años (Fontaine et al., 2003). Durante la obesidad, se produce una desregulación del balance entre la ingesta de calorías y el gasto energético, lo que se traduce en una acumulación masiva de lípidos en el tejido adiposo (TA) (Oussaada et al., 2019). El TA se ha considerado tradicionalmente como un tejido de almacén de las reservas energéticas del organismo, así como un mecanismo de aislamiento y protección mecánica para determinados órganos vitales. Sin embargo, hoy en día se sabe que es también un órgano endocrino clave en el organismo, capaz de sintetizar adipoquinas y numerosos factores que participan en la regulación de diversos mecanismos fisiológicos y metabólicos.
No obstante, en condiciones de obesidad, donde hay una sobrecarga masiva de lípidos, el TA sufre una serie de cambios patogénicos entre los que se incluyen la presencia adipocitos hipertróficos y disfuncionales y el desarrollo de fibrosis, hipoxia e inflamación (Arner et al., 2010; Crewe et al., 2017; Datta et al., 2018; Kahn et al., 2019; Weyer et al., 2000). Estos procesos conducen a una limitación en la capacidad de almacenamiento del TA, provocando que sean redirigidos a otros tejidos como el músculo esquelético o el hígado y desencadenen el desarrollo de resistencia a insulina y enfermedad metabólica (Carobbio et al., 2017; Danforth, 2000; Slawik & Vidal-Puig, 2007; Virtue & Vidal-Puig, 2010). En las últimas décadas se ha incrementado el interés por investigar los mecanismos que subyacen en el desarrollo de obesidad, así como la búsqueda de biomarcadores útiles que permitan predecir las alteraciones patológicas que se producen en el TA y otros tejidos relaciones durante dichas condiciones (Aleksandrova et al., 2020; López-Villar et al., 2015; Peinado et al., 2014). En este contexto, las técnicas ómicas han predominado en el campo de la investigación clínica, encontrándose tanto estudios genómicos y transcriptómicos como de tipo proteómico en modelos animales y humanos de obesidad (Aleksandrova et al., 2020; Novelle et al., 2017). Sin embargo, mientras que se han llevado a cabo estudios sobre la caracterización de los componentes del TA (Díaz-Ruiz et al., 2015; Guzmán-Ruiz et al., 2020; Peinado et al., 2011), o la repuesta a la pérdida de peso tras cirugía bariátrica (Moreno-Castellanos et al., 2016), los estudios de lipidómica del TA son más limitados, a pesar de que son componentes esenciales en la mayoría de los vertebrados (Fuchs, 2014). No obstante, gracias a los avances obtenidos en técnicas analíticas de separación de biomoléculas, así como su combinación con la espectrometría de masas, se pueden detectar una gran variedad de especies lipídicas de manera rápida, sensible y fiable que permitirán profundizar en el campo del estudio de los lípidos (lipidómica) en los diferentes tejidos, como el TA (Blanksby & Mitchell, 2010; Han et al., 2012). A pesar de que los mecanismos fisiológicos que conllevan a una alteración de la homeostasis lipídica en obesidad son complejos, ya que involucran a un elevado número de especies lipídicas y sus rutas metabólicas de biosíntesis están interconectadas, se ha propuesto que los esfingolípidos (ELs) y éter-fosfolípidos (EFLs) juegan un papel fundamental en el desarrollo de obesidad y resistencia a insulina o diabetes tipo 2 (Meikle & Summers, 2017). Por tanto, el conocimiento de los mecanismos que regulan la biosíntesis de estas formas lipídicas podría servir para el desarrollo de nuevas dianas terapéuticas en obesidad y enfermedad metabólica.
Por todo ello, el presente estudio fue concebido para investigar en detalle los cambios, cuantitativos y cualitativos, que afectan al lipidoma del TA en condiciones de obesidad y resistencia a la insulina, así como las posibles alteraciones que ocurren en las rutas de biosíntesis de los lípidos modificados en dichas condiciones.
2. Contenido de la investigación Los resultados obtenidos en el presente estudio se resumen en los siguientes puntos:
I. Desarrollo y puesta a punto de la metodología necesaria para el análisis de la distribución espacial de analitos en muestras altamente enriquecidas en lípidos, como el TA mediante la técnica de imagen de espectrometría de masas MALDI-IMS. En concreto, hemos desarrollado una metodología específica de análisis lipidómico del TA en la que las secciones son depositadas sobre una cinta de carbón conductiva y posteriormente recubiertas con la matriz DHB como paso previo a su análisis por MALDI-IMS. Adicionalmente, también hemos desarrollado protocolos de validación e identificación lipídica complementaria al análisis de MALDI-IMS mediante cromatografía líquida (LC-MS/MS).
II. Caracterización del lipidoma en modelos animales de obesidad inducida por dieta y tamaño de camada donde se identificaron importantes diferencias en la composición del lipidoma asociado al TA durante el desarrollo de obesidad. En concreto, se produjo un incremento de la concentración total de lípidos, siendo destacable un aumento significativo en la proporción de fosfolípidos constituidos por colina (LPC-Ps y PC-Ps), mientras que tanto la concentración de lípidos estructurales de la membrana plasmática (PEs y SMs), como la de lípidos señalizadores (PIs). En paralelo, los mapas de distribución espacial permitieron monitorizar los cambios en la zonación de las especies lipídicas SM(d18:0_18:2), acumulada en ratas obesas y asociada a regiones ocupadas por adipocitos y PC(O-16:0_16:1) y PE(P-16:0_20:0), disminuida en ratas obesas y relacionadas con la fracción de estroma vascular.
III. Caracterización del lipidoma en TA humano de obesos con diferente grado de sensibilidad a insulina donde se mostró una modificación sustancial del lipidoma en condiciones de enfermedad metabólica. En concreto, observamos un aumento de glicerofosfolípidos en general EFLs en particular, además de un descenso en los niveles de esfingomielinas en los insulino-resistentes y diabéticos con respecto a los normoglucémicos. Dadas las funciones ejercidas por estos lípidos (Santos & Preta, 2018), estos resultados sugieren que la remodelación de las membranas celulares, ,sobre todo en adipocitos hipertróficos, podría constituir un mecanismo adaptativo del TA para facilitar su expansión durante el desarrollo de obesidad y enfermedad metabólica. Por otra parte, se observó que los niveles de ceramidas estaban disminuidos a medida que progresaba la enfermedad metabólica, sugiriendo que la desregulación de estas formas lipídicas podría ser un factor agravante en el desarrollo de esta comorbilidad (Kayser et al., 2019; Sokolowska & Blachnio-Zabielska, 2019). Además, el análisis de zonación lipídica mediante MALDI-IMS permitió detectar variaciones en la distribución espacial tanto de algunas formas de plasmalógenos [PE(O-16:0_18:1), PC(P-16:0_20:5) y PC(O-18:0_18:2) como de la esfingomielina SM(d18:1_22:0), conforme progresa la enfermedad metabólica. Mientras que la esfingomielina se acumulaba de manera preferente en áreas ocupadas por adipocitos, la distribución espacial de los plasmalógenos en el TA era más heterogénea, a excepción de la especie PC(P-16:0_20:5), que se correlacionaba de manera directa con la fracción de estroma vascular en el grupo de normoglucémicos.
IV. De manera complementaria a los estudios lipidómicos, se analizaron los niveles de expresión de las enzimas implicadas en la biosíntesis de esfingolípidos (ELs) y éter-fosfolípidos (EFLs) mediante el uso de modelos in vitro de adipocitos en condiciones de obesidad y resistencia a insulina. Nuestros resultados mostraron un patrón de expresión temporal de las enzimas encargadas de la biosíntesis de estos lípidos durante la adipogénesis, así como una clara compartimentalización de éstas en la membrana plasmática (ELs), peroxisomas (EFLs) y retículo endoplasmático (ELs y EFLs). Con respecto a los ELs, las enzimas encargadas de sintetizar esfingomielinas muestran un pico de activación a partir del día 3 de diferenciación mientras que las encargadas de la biosíntesis de ceramidas disminuyeron su expresión a partir de entonces. Por su parte, observamos que las enzimas que catalizan los primeros pasos de la biosíntesis de éter-lípidos en peroxisomas, mostraban niveles más elevados en etapas tempranas de la adipogénesis (i.e., al inicio de la acumulación de lípidos en gotas lipídicas) mientras que las enzimas localizadas en el RE incrementaban sus niveles de expresión en fases más tardías. Además, los resultados obtenidos en los modelos in vitro de resistencia a insulina sugieren que las condiciones de hiperglucemia/hiperinsulinemia y la inflamación que sufre el tejido en obesidad podría contribuir, mediante su efecto sobre los orgánulos celulares del adipocito, a una desregulación en la producción de ELs y EFLs, afectando tanto a la regulación de la fluidez de la membrana plasmática del adipocito como a su capacidad de respuesta frente al estrés oxidativo (Brites et al., 2004; Wallner & Schmitz, 2011).
3. Conclusión En este trabajo, se demuestra que la composición del TA no sólo sufre variaciones cuantitativas y cualitativas en su perfil lipídico, sino que además su distribución espacial se ve alterada durante el desarrollo de enfermedad metabólica asociada a obesidad. Por un lado, observamos que la transición de normoglucemia a resistencia a insulina y/o diabetes de tipo 2 en pacientes obesos está asociada a cambios significativos en la expresión de enzimas relacionadas con la síntesis de esfingolípidos y éter-fosfolípidos que podrían conducir a la disfunción de las membranas celulares. Conjuntamente, la zonación de estas formas lipídicas en TA mostró un patrón de asociación entre el estroma vascular y determinados éter-fosfolípidos mientras que las esfingomielinas se correlacionaron mayoritariamente con regiones enriquecidas en adipocitos. Por otro lado, los resultados presentados demuestran que existe un diseño temporal preciso de activación de la biosíntesis de esfingolípidos y éter-fosfolípidos en adipocitos y que éste es específico de los compartimentos intracelulares implicados. Finalmente, en este estudio se demuestra que las distintas condiciones patofisiológicas que cursan con obesidad y desarrollo de resistencia a insulina (inflamación e hiperglucemia/hiperinsulinemia) afectan de manera diferencial a las rutas de biosíntesis de lípidos en adipocitos.
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