Identificación de miarns con valor predictivo como biomarcadores de estrés biótico y abiótico en plantas de interés agronómico
- Autores: Maria José López Galiano
- Directores de la Tesis: María Dolores Real García (dir. tes.), Inmaculada García-Robles (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de València ( España ) en 2021
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Pilar García Agustín (presid.), Estefanía Contreras Navarro (secret.), José Miguel Blanca Postigo (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina y Biotecnología por la Universitat de València (Estudi General)
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
Las plantas son organismos sésiles que en su ambiente natural deben hacer frente a una serie de condiciones bióticas y abióticas que les son adversas. En el escenario de cambio climático en el que nos encontramos actualmente, es importante conocer cómo las plantas responden a estos factores para así poder mitigar las posibles pérdidas económicas y escasez de productos agrarios. Los cambios producidos en los patrones de precipitación y temperatura, no solo están afectando a la disponibilidad de agua para el riego o al desarrollo y calibre de frutos, sino que también inducen cambios en los patrones de dispersión de patógenos y plagas, facilitando su llegada más temprana a los cultivos o el contacto con nuevos patógenos. Por estos motivos, el desarrollo de nuevas estrategias que permitan la detección temprana del estrés en plantas es muy importante para la elaboración de proyectos alternativos de protección vegetal. Con esta finalidad, la identificación de genes o de elementos reguladores de la expresión génica que puedan ser usados como biomarcadores de la situación estresante puede ser de gran utilidad en este escenario.
Uno de los elementos reguladores de la expresión génica que mayor interés está suscitando, por su acción a nivel post-transcripcional, son los miARNs. Se trata de ARNs monocatenarios, de entre 20 y 24 nucleótidos, que actúan uniéndose de forma muy específica a su ARN mensajero diana ocasionando su efecto regulador en un momento y tejido concreto. Dada su especificidad, conocer el estatus de la planta estresada a nivel de expresión de miARNs y de sus dianas, podría ser muy informativo al revelar cómo la planta es capaz de ejecutar y coordinar la respuesta de defensa, convirtiéndose en potenciales biomarcadores de estrés. En este contexto, se plantea un experimento a gran escala en la solanácea de interés agronómico tomate sometida a seis condiciones distintas de estrés para la identificación de miARNs implicados en respuesta de defensa. Las condiciones de estrés aplicadas se corresponden con tres condiciones bióticas generadas por el daño ocasionado por el insecto plaga Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la patata; CPB, por sus siglas en inglés de “Colorado Potato Beetle”), la bacteria patógena Pseudomonas syringae y el hongo necrótrofo Botrytis cinerea, y tres condiciones abióticas, sequía, incremento de temperatura y tratamiento con el inductor de las defensas ácido hexanoico (Hx). Los resultados de esta aproximación para la identificación de miARNs biomarcadores de respuesta a estrés quedan resumidos en el capítulo 1. En el proceso de secuenciación masiva se identificaron 104 miARNs pertenecientes a 37 familias distintas y se predijeron 61 miARNs noveles, de los cuales 41 miARNs se expresaban de forma diferencial en respuesta a estrés. La predicción de dianas de estos miARNs reveló un total de 279 probables dianas génicas. Once miARNs fueron seleccionados para su validación por RT-qPCR, analizándose también mediante la misma técnica la expresión de algunas de las dianas génicas de 4 de ellos. Por otro lado, se puso a punto la técnica CRISPR/Cas9 para la validación funcional de los miARNs, sly-miR171a, implicado en defensa frente al insecto plaga CPB, y sly-miR6022, implicado en respuesta a sequía. Los resultados mostraron que, aunque el proceso de generación de los vectores CRISPR/Cas9 y la regeneración de plántulas se había logrado, no se consiguió generar en última instancia mutaciones en el gen MIR que permitieran llevar a cabo la validación funcional de los miARNs bajo estudio.
Dada la especificidad en el modo de acción de los miARNs, en el capítulo 2 se analiza la respuesta específica coordinada por el miARN sly-miR159, mediante el análisis de la regulación ejercida por este miARN sobre los factores de transcripción MYB (homólogos del oncogén viral de mieloblastosis V-Myb) en dos condiciones de estrés diferentes, sequía y daño ocasionado por el insecto CPB. Los resultados mostraron que, en condiciones de sequía, sly-miR159 regula específicamente la expresión del factor de transcripción SlMYB33 para generar un ambiente osmoprotector en la planta de tomate, y que esta respuesta es diferente de la observada frente al daño ocasionado por el insecto herbívoro.
En el tercer capítulo, se analiza la implicación del factor de transcripción WRKY75 en la respuesta de defensa en plantas de tomate. Se observó que este gen se expresaba de forma diferencial únicamente en los estreses bióticos bajo estudio, destacando una fuerte inducción en la infección ocasionada por el hongo B. cinerea, y que podría tratarse de un elemento regulador de la vía del ácido jasmónico. Se identificó por primera vez el miARN sly-miR1127-3p como elemento regulador del factor de transcripción WRKY75 en respuesta a la infección fúngica, y se propuso que su modo de acción podría relacionarse con mecanismos de regulación epigenéticos junto con la presencia de la marca H3K4me3.
Finalmente, en el último capítulo, se abordan los mecanismos que subyacen en el efecto de “priming” generado por Hx en la solanácea berenjena. No se conocen en profundidad las bases del efecto de “priming” generado por Hx, por lo que la detección de biomarcadores de este efecto es de gran importancia. En plantas de berenjena tratadas con este agente inductor de defensas, se caracterizó el gen MLP (“Miraculin Protease Inhibitor”) como un gen marcador de este efecto en las plantas dañadas por el insecto CPB, además de ser un gen de respuesta al daño generado por B. cinerea y a condiciones de sequía.
Los resultados presentados en esta tesis muestran la gran coordinación fisiológica y molecular que llevan a cabo las plantas para superar las condiciones desfavorables a las que están sometidas. Los mecanismos de regulación génica mediados por miARN se erigen como unos componentes clave de esta plasticidad mostrada por la planta en condiciones de estrés, debido a que estos elementos génicos median la expresión de genes de defensa, de genes implicados en desarrollo y de factores de transcripción, y que a su vez actúan de forma coordinada con las vías de señalización hormonal. Por otro lado, el efecto de “priming” generado en la planta por el tratamiento con Hx emerge como una nueva alternativa con múltiples aplicaciones en campo, incluida su aplicación contra los insectos herbívoros.
