Análisis de la especificidad de nucleótido y fidelidad de copia de variantes de la retrotranscriptasa del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1

• Autores: Clara Elisa Cases González
• Directores de la Tesis: Luis Menéndez Arias (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2004
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Juan Ortón Montón (presid.), José M. Requena Rolanía (secret.), Luis Blanco Dávila (voc.), Enrique Viguera Mínguez (voc.), C. López Galíndez (voc.)
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• Resumen

  • La retrotranscriptasa(RT)del virus de la inmunodeficienciahumanatipo 1 (HIV-1)es una enzimamultifuncionalcon actividades ADN polimerasa dependiente de ADNy ARN,RNasa H, y transferencia y despazamiento de hebra. Es un heterodímero compuesto por dos subunidades, p66 y p51, que contienen los subdominios denominados ""fingers, ""thumb"", ""palm"" y ""connection"", y un dominio RNasa Hen la subunidad mayor. Los resíduos Ala-114 y Tyr-115,junto con otros residuos como Asp-113 y Gln-151, forman el bolsillo que acomoda el grupo 3'-OHdel nucleótido entrante.

    El residuo Met-230se encuentra localizado en una región muy conservada denominada ""primer grip"", respondable del mantenimiento del extremo del iniciador en una posición apropiada para que se lleve a cabo el ataque nucleofílico sobre un dNTP entrante. En esta Tesis Doctoral se ha estudiado el efecto de mutaciones en las posiciones 114, 115 Y230 sobre la fidelidad de síntesis de ADNy la especificidad de nucleótido en diferentes condiciones, utilizando para ello ensayos bioquímicos de incorporación de nucleótido basados en gel así como un nuevo ensayo genético para medir la frecuencia de mutación G/A durante la síntesis de ARNdependiente de ADN.%&/Sustituciones no conservadas de la Tyr-115 provocan una disminución en la fidelidad de síntesis de ADNen presencia de Mgcomo cofactor.

    La presencia de Mntiene un efecto mutagénico en la polimerización de ADN,que opera principalmente a nivel de la extensión de extremos desapareados.

    Es necesario un aminoácido aromático en la posición 115 para discriminar frente a nucleótidos que contienen un grupo 2'-OH, participando la Tyr-115 como barrera estérica. Las sustituciones de Ala-114 no parecen influir sobre la fidelidad de la enzima,aunque este aminácido sí que contribuye en la discriminación frente a ddNTPs.

    Mutantes en la región del ""primer grip"", como M2301y M230L,se comportan como altamente mutagénicos en presencia