Resumen de Identification and phylogeny of clinical and environmental isolates of alternaria, cladosporium and other genera of dematiaceous hyphomycetes
Justificación y necesidades de la investigación Los hongos se consideran uno de los grupos más extensos de organismos, con un papel transcendental en el mantenimiento del equilibrio de los ecosistemas, encontrándose como saprobios, degradando materia orgánica, así como asociados a otros organismos como endófitos, simbiontes, pero también como parásitos de plantas, animales y el hombre. Sin embargo, a pesar del su papel destacado en la naturaleza, su biodiversidad es todavía muy desconocida. En las últimas décadas, el uso de herramientas moleculares como el análisis de secuencias de ADN pone de manifiesto que la diversidad de especies fúngicas es mucho mayor de lo que se había descrito con anterioridad. Existe, por tanto, un importante número de especies todavía por descubrir, no sólo presentes en nichos ecológicos poco explorados, sino también asociadas a sustratos comunes de nuestro entorno (suelo, material vegetal, etc.), poco estudiados con dichas herramientas. A título de ejemplo, gracias al análisis de secuencias de los genes ribosómicos, así como de otros genes, en los últimos años se han descrito un gran número de especies crípticas de géneros cosmopolitas, como Aspergillus, Fusarium o Penicillium, entre las que destacan importantes patógenos humanos o productores de metabolitos secundarios con una amplia gama de aplicaciones en distintos campos. Por tanto, delimitar y caracterizar nuevas especies, así como la correcta identificación de los hongos asociados a un determinado sustrato o ambiente, no sólo nos permitirá conocer con más precisión la diversidad fúngica y entender mejor su papel en dicho espacio, sino que también vamos a contribuir al mejor conocimiento de la evolución de los hongos mediante el estudio de las relaciones filogenéticas de, cada vez, un mayor número de hongos conocido.
Teniendo en cuenta dichas consideraciones, la presente tesis se ha centrado principalmente en el estudio de cepas de Alternaria y Cladosporium. Ambos géneros incluyen especies descritas como importantes patógenos para plantas, pero también capaces de producir serias infecciones en animales y el hombre, especialmente en individuos inmunocomprometidos. Sin embargo, su taxonomía es muy compleja debido al elevado número de especies que incluye cada uno de ellos y a la gran similitud morfológica que hay entre muchas de esas especies, lo que dificulta considerablemente su identificación. En muchos estudios, los aislados de Alternaria y Cladosporium se identifican únicamente a nivel de género, o complejo de especies, en caso de no recurrir a un apropiado análisis multigénico de las cepas, lo que impide claramente conocer la biodiversidad fúngica asociada a un determinado ambiente o sustrato. En el ámbito clínico, la no identificación de las cepas limita, por ejemplo, la comparación de datos sobre sensibilidad antifúngica entre especies, dificultando la aplicación de tratamientos adecuados, pero también impide realizar estudios epidemiológicos de sus especies patógenas. Cabe destacar que del género Alternaria nos hemos centrado particularmente en estudiar los miembros de la sección Infectoriae debido al desconocimiento que existe todavía sobre su taxonomía y la creciente incidencia en estos últimos años de casos de infecciones humanas causadas por este grupo.
Por todo lo expuesto podemos indicar, por tanto, que el objetivo general de esta tesis ha sido estudiar la diversidad de especies en Alternaria y Cladosporium, así como la de otros géneros morfológicamente similares o filogenéticamente relacionados, a partir de cepas ambientales y clínicas, mediante herramientas moleculares para su correcta identificación o resolución de la taxonómica de aquellas especies poco conocidas o incluso no descritas para la ciencia.
Por último, indicar que todas las cepas estudiadas en esta tesis están debidamente conservadas en la colección de cultivos de la Facultad de Medicina de Reus, así como el cultivo de cepas de especies raras o nuevas para la ciencia depositadas en colecciones internacionales de acceso público, poniéndolas, por tanto, a disposición de la comunidad científica para futuros estudios en distintos campos de la ciencia.
Metodología utilizada Se han estudiado un total de 589 cepas, de las cuales 56 son de origen clínico, procedentes de tres diferentes instituciones [Universidad de Texas (Texas, EUA), laboratorio de referencia del Hospital universitario San Joan (Reus, España) y del centro de Microbiología del Instituto de salud Carlos III (Madrid, España)], y 533 de origen ambiental (200 de suelo, 204 de heces de herbívoros y 129 de material vegetal). Entre los aislados de origen clínico 54 fueron recibidos presuntivamente identificados como Alternaria sp. y 2 como Curvularia sp.
Las cepas de origen ambiental se aislaron de muestras de suelo, restos vegetales y estiércol colectadas principalmente en España, pero también de muestras procedentes de México y Vietnam. Adicionalmente, y con el objetivo de dilucidar la taxonomía de alguno de los géneros investigados, se estudiaron también diversas cepas de referencia procedentes del “Westerdijk Fungal Biodiversity Institute” (Utrecht, Países Bajos).
Las muestras de estiércol se procesaron mediante dos metodologías, incubación de la muestra en cámara húmeda y técnica de dilución y sembrado en placa. Las muestras de suelo también se procesaron mediante la técnica de dilución en placa, además de la técnica de anzuelo. Las muestras de material vegetal se incubaron exclusivamente en cámara húmeda. Todas las placas se examinaban periódicamente y los hongos de interés para nuestros estudios se aislaban paulatinamente en diferentes medios de cultivo para la obtención de cultivos puros y su posterior estudio fenotípico y molecular.
Para el estudio molecular, se secuenciaron diversos marcadores filogenéticos, dependiendo del género en estudio, con el fin de obtener la correcta identificación de las especies. Para aquellas cepas de identificación dudosa debido a que sus secuencias presentaban porcentajes de identidad < 98 % respecto a las secuencias principalmente de las cepas tipo de especies bien establecidas, se secuenciaron marcadores adicionales con el fin de poder realizar análisis multigénicos y delimitar con más precisión las especies filogenéticas. De esta forma, para dilucidar la taxonomía de las cepas de Alternaria se realizaron análisis multigénicos con ITS, ATPase, gapdh, rpb2 y tef1; para las cepas del género Cladosporium ITS, act y tef1; para cepas de Curvularia ITS, gapdh y tef1, y para el estudio filogenético de cepas de otros géneros de interés taxonómico se combinaron principalmente los marcadores ITS y LSU, aunque en ciertos casos también se incorporó un marcador adicional de acuerdo a lo recomendado previamente en la literatura. Los estudios filogenéticos se llevaron a cabo a través de análisis Maximum-likelihood, desarrollado en el programa MEGA versión 6.0. o en la plataforma Cipres versión 3.3, y a través de Inferencia Bayesiana realizada en el programa MrBayes versión 3.1.2.
El estudio fenotípico de las especies de interés se realizó a través de la caracterización macroscópica de sus colonias en diferentes medios de cultivo, siendo PDA, PCA y OA los más comúnmente utilizados, y a través del estudio microscópico de sus estructuras de esporulación a partir de los medios de cultivo previamente indicados o de los específicamente recomendado en la literatura según el género en estudio. De esta forma se utilizó PCA para cepas de Alternaria, SNA para Cladosporium o PDA para Curvularia. Adicionalmente, se estudió el perfil de crecimiento de las cepas a diferentes temperaturas de incubación con el objetivo de determinar las temperaturas cardinales de crecimiento de la especie.
Conclusiones más relevantes Sobre el estudio de cepas del género Alternaria de origen clínico y ambiental concluimos que: 1- Es preciso realizar un análisis multigénico con ITS, ATPase, gapdh, rpb2 y tef1 para delimitar e identificar correctamente las especies de la sección Infectoriae dentro del género, mientras que la filogenia de las especies de otras secciones del género estudiadas (Chalastospora, Pseudoalternaria y Radicina) se resuelve con el análisis de un menor número de estos marcadores.
2- El estudio polifásico ha permitido proponer 13 nuevas especies para el género (A. aconidiophora, A. anthropophila, A. atrobrunnea, A. curvata, A. fimeti, A. guarroi, A. lawrencei, A. montsantina y A. pseudoventricosa en la sección Infectoriae; A. alcampina y A. inflata en la sección Pseudoalternaria; A. pobletensis en la sección Chalastospora; y A. chlamydosporifera en la sección Radicina).
3- Se ha demostrado que las nuevas especies A. anthropophila, A. atrobrunnea y A. guarroi son agentes etiológicos de infección cutánea humana. Debido a que los perfiles de sensibilidad antifúngica obtenidos parecen ser especie-dependiente, es relevante la correcta identificación de las cepas de Alternaria a nivel de especie para el establecimiento de un tratamiento adecuado.
4- Entre los aislados clínicos de Alternaria, se han identificado por primera vez A. rosae y A. kordkuyana asociadas a especímenes humanos, aunque sin rol patogénico probado.
5- Teniendo en cuenta que ninguno de los aislados clínicos de Alternaria fueron identificados como A. infectoria, consideramos que dicha especie está sobreestimada como patógeno oportunista humano en la literatura médica.
6- Entre las cepas de Alternaria de origen ambiental, se han identificado un total de 27 especies distribuidas en diferentes secciones (Alternaria, Chalastospora, Infectoriae, Ulocladium, Ulocladioides, Pseudoalternaria y Radicina).
7- Las muestras de heces de herbívoros, a diferencia de suelo y material vegetal, resultaron ser un excelente sustrato para el aislamiento de cepas de Alternaria de interés taxonómico, debido a que ocho de las 23 especies identificadas se han propuesto como nuevas para la ciencia (A. altcampina, A. chlamydosporifera, A. curvata, A. fimeti, A. inflata, A. lawrencei, A. pobletensis y A. pseudoventricosa), y nueve se consideran especies raras por ser mayoritariamente monotípicas (A. armoraciae, A. cantlous, A. heterospora, A. gaisen, A. kordkuyana, A. rosae, A. merytae, A. oregonensis y A. slovaca).
Sobre el estudio de las cepas del género Cladosporium y de otros hongos morfológicamente similares hemos concluido que: 8- El marcador molecular tef1 es adecuado para la identificación o detección de cepas de Cladosporium de interés taxonómico, mientras que el análisis multigénico con dicho marcador además de ITS y act permite la adecuada caracterización molecular de nuevas especies en el género.
9- Entre las cepas de Cladosporium s. str. se han identificado un total de 37 especies conocidas y siete nuevas especies para la ciencia (C. caprifimosum, C. coprophilum, C. fuscoviridum, C. lentulum, C. michoacanense, C. pseudotenellum y C. submersum).
10- Todas las especies de Cladosporium identificadas se distribuyen entre los tres complejos de especies descritos en el género, siendo el complejo C. cladosporioides, el que mostró una mayor diversidad y, a su vez, C. cladosporioides la especie más frecuentemente aislada.
11- Las muestras de estiércol de herbívoro y de suelo mostraron una diversidad de especies similar y levemente superior a la observada en el material vegetal, sin embargo, el espectro de especies identificadas fue diferente en los tres tipos de muestras estudiados.
12- Cinco de los aislados con morfología cladosporioide, obtenidos en su mayoría de restos vegetales, resultaron ser nuevas especies para la ciencia. Los estudios filogenéticos realizados permitieron resolver la posición taxonómica en algunos de ellos, situando Apenidiella foetida en la familia Teratosphaeriaceae (Capnodiales), Matsushimaea monilioides en la familia Sympoventuriaceae y Venturia submersa en la familia Venturiaceae, ambos géneros pertenecientes al orden Venturiales, y Pseudopenidiella gallaica y P. vietnamensis en la familia Microthyriaceae (Microthyriales).
Sobre el estudio de otros géneros dematiáceos incluidos en la presente tesis concluimos que: 13- Los análisis filogenéticos de las regiones ITS y LSU nos permitieron proponer el nuevo género Neodendryphiella dentro de la familia Dictyosporiaceae (Pleosporales), con la introducción de 3 nuevas especies (N. tarraconensis, N. michoacanensis y N. mali), así como una nueva especie en el género Dendryphiella (D. variabilis). A su vez, dicho análisis nos permitió proponer una nueva especie en Heliocephala (H. variabilis) que, gracias a nuestro estudio, este género se describe como miembro de la familia Microthyriaceae.
14- Los análisis filogenéticos multi-locus de las regiones ITS, gapdh y tef1 de los aislados pertenecientes al género Curvularia nos permitieron proponer 3 nuevas especies, Cu. paraverruculosa y Cu. vietnamensis aisladas de suelo y material vegetal respectivamente, y Cu. suttoniae aislada de muestras clínicas humanas.
15- Los análisis filogenéticos multi-locus de las regiones ITS, LSU y tub2 nos permitieron describir la nueva especie Cyphellophora vietnamensis y, a su vez, proponer dos nuevas combinaciones dentro del género (Cy. attae y Cy. capiguarae), basados en dos especies previamente clasificadas dentro del género Phialophora.
16- Considerando que muchos de los hongos taxonómicamente interesantes estudiados en la presente tesis fueron aislados directamente del sustrato natural (estiércol de herbívoros, suelo y restos vegetales) incubado en cámara húmeda o en placas aplicando la técnica de anzuelo, concluimos que son técnicas que deberían ser incluidas en futuros estudios sobre diversidad de hifomicetes dematiáceos.
