Resumen de Understanding pathogenicity-related mechanisms in the rice blast fungus magnaporthe oryzae
Magnaporthe oryzae es un hongo ascomiceto que causa la piriculariosis, una de las enfermedades fúngicas más graves del cultivo de arroz (Oryza sativa L.). La identificación de proteínas de unión a ARN, específicas de hongos, está ayudando a desentrañar las redes postranscripcionales y los procesos celulares que confieren identidad al reino fúngico. Rbp35 es una proteína de unión a ARN y un componente exclusivo de la maquinaria de poliadenilación de hongos filamentosos. Rbp35 no es esencial para la viabilidad fúngica, pero regula la longitud de los 3' UTRs de transcritos que tienen funciones asociadas al desarrollo y la virulencia. La falta de ortólogos claros de Rbp35 en levaduras, plantas y animales indica que Rbp35 podría usarse como una diana fúngica para desarrollar compuestos antifúngicos.
Aquí, analizamos la regulación ejercida por el intrón localizado en el 5' UTR de RBP35 y el marco de lectura abierto aguas arriba (uORF1), e investigamos cómo esta regulación modula la función Rbp35 en la célula. También mostramos la influencia de la poliadenilación alternativa en la patogenicidad de M. oryzae al observar las diferencias mostradas por las isoformas de ARNm de 14-3-3B durante la infección, las cuales son reguladas por Rbp35. Finalmente, estudiamos la regulación del Hrp1 de M. oryzae, otro componente del Factor de escisión I de la maquinaria de poliadenilación específica de hongos.
La región 5' no traducida (5' UTR) del gen RBP35 tiene 733 nucleótidos (nt) de largo, inusualmente grande en comparación con el tamaño medio de los 5 'UTRs en M. oryzae. El intrón localizado en el 5' UTR de RBP35 incluye dentro de su secuencia un marco de lectura abierto aguas arriba (uORF1) y parte de un segundo uORF (uORF2) capaz de generar péptidos de 36 y 72 aminoácidos, respectivamente. Esta característica no se encuentra en ningún otro gen de M. oryzae. Mostramos que la presencia del intrón 5' UTR inhibe la traducción de la secuencia codificante de la proteína RBP35. Además, los enfoques bioquímicos y genéticos revelan que el intrón del 5’ UTR bloquea la traducción de la secuencia principal de codificación aguas abajo, es decir, RBP35. Los perfiles polisomales confirman la capacidad del 5’ UTR para desequilibrar la cantidad de ARNm de RBP35 que se encuentra en las fracciones polisomales. Además, encontramos que el péptido uORF1 puede desempeñar un papel independiente en la célula fúngica, una característica inusual para los uORF.
Seleccionamos el gen 14-3-3B, ya que su pre-ARNm está poliadenilado por Rbp35, para estudiar la influencia de la poliadenilación alternativa en la biología de M. oryzae. Las proteínas 14-3-3 son proteínas de armazón que participan en las cascadas de señalización, incluido en la vía de señalización de la ruta TOR. El mutante Δ14-3-3b muestra defectos significativos en la respuesta fúngica al estrés osmótico y la patogenicidad del hongo. La reintroducción de construcciones genéticas de 14-3-3B en el mutante Δ14-3-3b que contienen un 3' UTR corto y largo revela que el desarrollo de hongos o la respuesta al estrés osmótico no se ven afectados por la selección del sitio de poliadenilación. Sin embargo, la selección del sitio de poliadenilación distal controla los niveles de proteína y ARNm de 14-3-3B, y es crucial para el proceso de infección de M. oryzae.
Hrp1 es una proteína de unión a ARN del segundo componente CFI presente en hongos filamentosos. La levadura contiene solo un CFI formado por Hrp1, y carece del segundo CFI que se encuentra exclusivamente en hongos filamentosos, que está compuesto por Rbp35 y CFI25. Mientras que Hrp1 es un gen esencial en la levadura, la eliminación de MoHRP1 en M. oryzae genera un mutante que todavía es viable, aunque muestra graves deficiencias de desarrollo. El Hrp1 de levaduras puede recuperar parcialmente los defectos del mutante mohrp1. Sin embargo, Hrp1 de M. oryzae no es funcional en la levadura. Estos resultados sugieren que las funciones de estas proteínas difieren entre estos dos organismos. Ensayos de doble híbrido en levadura demuestran la interacción entre MoHrp1 y Rbp35, apoyando la divergencia funcional encontrada entre estos dos organismos.
En general, este trabajo de investigación ha contribuido a aumentar nuestro conocimiento sobre la relevancia de los elementos reguladores localizados en regiones no codificantes de la proteína de unión a ARN Rbp35, y el papel significativo que juegan los componentes de la maquinaria de poliadenilación fúngica y la poliadenilación alternativa durante la colonización de M. oryzae en el arroz.
SUMMARY Magnaporthe oryzae is an ascomycetous fungus that causes the rice blast, one of the most serious fungal diseases on rice (Oryza sativa L.). Identification of fungal-specific RNA-binding proteins is helping to unravel post-transcriptional networks and cellular processes that confer identity to the fungal kingdom. Rbp35 is an RNA-binding protein exclusive to the polyadenylation machinery of filamentous fungi. M. oryzae Rbp35 is not essential for fungal viability but regulates the length of 3’UTRs of transcripts with development- and virulence-associated functions. The lack of clear Rbp35 orthologues in yeast, plants and animals indicates that Rbp35 could be used as a fungal target to develop anti-fungal drugs.
Here, we analyse the regulation exerted by the RBP35 5’UTR intron and upstream open reading frame (uORF1), and investigate how this regulation modulates Rbp35 function in the cell. We also show the influence of alternative polyadenylation in M. oryzae pathogenicity by looking at the differences displayed by Rbp35-dependent mRNA isoforms of 14-3-3B during rice blast infection. Finally, we study the regulation of M. oryzae Hrp1, another component of the Cleavage Factor I of the fungal-specific polyadenylation machinery.
The 5’ untranslated region (5’ UTR) of the RBP35 gene is 733 nucleotides (nt) long, unusually large for a standard fungal 5’ UTR. The RBP35 5’UTR intron includes within its sequence a full upstream open reading (uORF1) and part of a second uORF (uORF2) capable of generating 36- and 72-aminoacid long peptides, respectively. This feature is not found in any other M. oryzae gene. We show that the presence of the 5’ UTR intron inhibits the translation of the RBP35 protein-coding sequence. Furthermore, biochemical and genetic approaches reveal that uORF1 blocks the translation of the main downstream coding sequence, i.e. RBP35. Polysomal profiles confirm the ability of the 5’ UTR to unbalance the amount of RBP35 mRNAs found in polysomal fractions. In addition to the inhibitory role of uORF1 over the main downstream protein-coding sequence, we found that uORF1 peptide can play an independent role in the fungal cell, an unusual feature for uORFs.
We select the 14-3-3B gene since its pre-mRNA is polyadenylated by Rbp35 to study the influence of alternative polyadenylation in M. oryzae biology. The 14-3-3 proteins are scaffold proteins that participate in signaling cascades, including the target of rapamycin (TOR) signaling pathway. The Δ14-3-3B mutant shows significant defects in the fungal response to osmotic stress and fungal pathogenicity. The reintroduction of genetic constructs of 14-3-3B in the Δ14-3-3B mutant that contain a short and a long 3’UTR reveals that fungal development or the osmotic stress response are not affected by the polyadenylation site selection. However, the selection of distal polyadenylation site controls 14-3-3B mRNA and protein levels, and is crucial for fungal infection.
Hrp1 is a RNA-binding protein component of the second CFI present in filamentous fungi. Yeast contains only one CFI formed by Hrp1, and lacks the second CFI found exclusively in filamentous fungi, which is composed by Rbp35 and CFI25. Whereas Hrp1 is an essential gene in yeast, the deletion of MoHRP1 in M. oryzae is still viable although the mutant displays severe development deficiencies. Yeast Hrp1 is able to recover partially the defects of M. oryzae mohrp1 mutant. However, the M. oryzae Hrp1 is not functional in yeast. These results suggest that the roles of these proteins differ between these two organisms. Yeast two hybrid assays demonstrate the interaction between MoHrp1 and Rbp35, supporting the functional divergence found.
Overall, this research work has contributed to increase our knowledge on the relevance of the regulatory elements localized in non-coding regions of the RNA-binding protein Rbp35, and the significant role that components of the fungal polyadenylation machinery and alternative polyadenylation play during M. oryzae rice colonisation.
