Mechanisms involved in the degradation of the strigolactone receptor DWARF14 in arabidopsis thaliana

• Autores: Elena Sánchez
• Directores de la Tesis: Pilar Cubas Domínguez (dir. tes.), Cristina Ortega Villasante (tut. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2021
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Salomé Prat (presid.), Rafael Rivilla Palma (secret.), Catherine Rameau (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares por la Universidad Autónoma de Madrid
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología vegetal (botánica)
      • Desarrollo vegetal
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • Strigolactones (SL) are phytohormones involved in many developmental processes, such as the inhibition of shoot branching. DWARF14 (D14), the SL receptor in Arabidopsis thaliana, is an α/β hydrolase that binds and hydrolyzes the hormone. After SL binding, D14 interacts with MORE AXILLARY GROWTH2 (MAX2), an F-box protein part of a SKP1-Cullin-F-box (SCF) ubiquitin ligase complex, and the transcriptional repressors SUPPRESOR OF MAX2-1 LIKE6 (SMXL6), SMXL7 and SMXL8. Once the signaling complex is formed, SCFMAX2 targets the repressors for proteasome-mediated degradation, which activates the SL signaling responses. However, after hormone perception and activation of the SL signaling pathway, D14 is also degraded.

    In this work, we have developed two different bioassays to quantitatively analyze D14 protein degradation dynamics in vivo: luminescence- and fluorescence-based time-lapse assays. In order to identify the molecular mechanisms involved in D14 degradation, we have studied D14 proteolysis in different plant tissues and genetic backgrounds. We have also generated and studied Arabidopsis transgenic lines overexpressing a collection of D14 point mutants expected to affect SL binding or hydrolysis, or to impair protein-protein interactions with other components of the SL signaling complex. As a readout for SL signaling and response, and to investigate its association with D14 proteolysis, we measured the degradation of the repressor SMXL7 using luminescence-based assays.

    By comparing D14 degradation in hypocotyl and roots we have shown that it follows different dynamics in these tissues. We have also found that interaction with MAX2 or the SMXL6,7,8 is not required for D14 degradation. Moreover, D14 is not targeted for proteolysis exclusively by the SCFMAX2 proteasome-mediated pathway, but also by an alternative mechanism that is MAX2- and proteasome-independent. In addition, we have identified a putative, non-canonical ubiquitination of D14 in non-lysine residues. We have also demonstrated that SL-hydrolysis is not necessary for D14 proteolysis, D14-SMXL7 interaction or SMXL7 degradation.

    To study the role of D14 degradation over its function in shoot architecture, we have analyzed the branching and plant height phenotype -as well as SMXL7 degradation- of our collection of transgenic lines overexpressing D14 point mutants. We have found that the capability of D14 mutants to suppress shoot branching generally correlates with the degree of SMXL7 degradation, and that the role of D14 on branch suppression can be separated from that on plant height.

    __________________________________________________________________________________________ Las estrigolactonas (SL) son hormonas vegetales involucradas en múltiples procesos de desarrollo, entre los que destaca la inhibición de la ramificación. El receptor de SL en Arabidopsis thaliana es DWARF14 (D14), una α/β hidrolasa con capacidad de unir e hidrolizar la hormona. Tras la unión a SL, D14 interacciona con MORE AXILLARY GROWTH2 (MAX2; una proteína F-box que forma parte de un complejo SKP1-Cullin-F-box, SCF, de ubiquitina ligasas) y con los represores transcripcionales SUPPRESOR OF MAX2-1 LIKE6 (SMXL6), SMXL7 y SMXL8. Una vez formado el complejo de señalización, SCFMAX2 reconoce y envía a los represores al proteasoma para su degradación, lo que permite la activación de la respuesta a SL. Posteriormente, tras detectar las SL y activar su ruta de señalización, el receptor D14 también se degrada.

    En este trabajo hemos desarrollado dos bioensayos “time-lapse” para el análisis cuantitativo de la dinámica de degradación de D14 in vivo basados en fluorescencia o en luciferasa. Para identificar los mecanismos moleculares que controlan la degradación de D14 hemos estudiado la misma en diferentes tejidos vegetales y fondos genéticos. Además, hemos generado y estudiado líneas transgénicas de Arabidopsis que sobreexpresan una colección de mutantes puntuales de D14 que se espera tengan afectadas la unión o hidrólisis de SL, o las interacciones proteína-proteína con el resto de componentes del complejo de señalización hormonal. Finalmente, hemos usado la degradación del represor SMXL7 como sensor de la señalización y respuesta a SL, así como para analizar su relación con la proteólisis de D14.

    Gracias a la comparación de la degradación de D14 en hipocótilos y raíces de plántulas, hemos hallado que esta sigue una dinámica diferente en ambos tejidos. En este trabajo también hemos observado que D14 no necesita la interacción con MAX2 ni con SMXL6,7,8 para su degradación. Además, nuestros resultados muestran que SCFMAX2 y el proteasoma no son los únicos responsables de la proteólisis de D14, y que existe un mecanismo alternativo que es independiente de MAX2 y del proteasoma. Por otro lado, hemos detectado ubiquitinación no canónica de D14 en residuos diferentes a las lisinas. A su vez, hemos demostrado que la hidrólisis de SL no es necesaria para la interacción D14-SMXL7 ni para la degradación de ambas proteínas.

    Desde un punto de vista funcional, hemos estudiado el papel de la degradación de D14 en el desarrollo de la arquitectura de las plantas, analizando los fenotipos de altura y ramificación (así como la degradación de SMXL7) en líneas transgénicas de Arabidopsis que sobreexpresan nuestra colección de mutantes puntuales de D14. Este estudio nos ha permitido identificar que la capacidad de los mutantes de D14 para controlar la ramificación está asociada al nivel de degradación de SMXL7, y que el papel que juega D14 en la inhibición de la ramificación se puede separar de su rol en el control de la altura de la planta.