Estudio de proteínas con dominio TIR humanas y bacterianas, mediante su expresión heteróloga en Saccharomyces cerevisiae

• Autores: Julia María Coronas Serna
• Directores de la Tesis: Victor Jiménez Cid (dir. tes.), María Molina Martín (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2021
• Idioma: español
• Número de páginas: 210
• Títulos paralelos:
  • Study of human and bacterial TIR domain-containing proteins, through their heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae
• Tribunal Calificador de la Tesis: Bruno González Zorn (presid.), Lucía Monteoliva (secret.), Claudio Sette (voc.), Félix Javier Sangari García (voc.), Javier Jiménez Jiménez (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Microbiología y Parasitología por la Universidad Complutense de Madrid
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Microbiología
      • Micología (levaduras)
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense
• Resumen
  • español

    Los seres vivos utilizan la señalización por receptores Toll-like (TLR) para detectar patógenos. Al reconocer un ligando, los TLRs amplifican la señal formando Centros Organizadores Supramoleculares (SMOCs), e induciendo la respuesta inflamatoria. Los SMOCs contienen proteínas con dominios de interacción, como el dominio Toll/interleukin-1 receptor (TIR). El TLR4 señaliza desde dos SMOCs, el myddosoma y el triffosoma, que contienen a TIRAP y MyD88 o TRAM y TRIF, respectivamente. Las proteínas TIR están en diversos organismos y aún no se conocen todas sus funciones. No sólo interaccionan, sino que algunos consumen el cofactor NAD(+) enzimáticamente. Son parte de la inmunidad en plantas y animales y algunos patógenos producen efectores TIR para sabotear la inmunidad del hospedador. Brucella es un patógeno intracelular que tiene dos efectores TIR, BtpA y BtpB, ambos secretados por su sistema de secreción tipo 4. BtpA degrada el NAD(+), y junto a BtpB, bloquean la señalización por TLR y estabilizan los microtúbulos del hospedador. Para estudiar con un nuevo enfoque las proteínas TIR humanas y bacterianas, hemos desarrollado un modelo en la levadura Saccharomyces cerevisiae, modelo celular eucariótico con mecanismos conservados y fácil manejo en laboratorio. Varios modelos de enfermedad humana o de virulencia bacteriana han sido diseñados por nuestro grupo de investigación en este sistema. El objetivo de esta tesis es reconstruir los SMOCs humanos de TLR4 mediante expresión heteróloga en levadura, y así descifrar los fenotipos derivados de la expresión de BtpA y BtpB de Brucella, además de comprender los efectos de las proteínas TIR humanas y bacterianas cuando son coexpresadas. Nuestros resultados indican que BtpA y BtpB inhiben el crecimiento de levadura a través de sus dominios TIR, mientras que las regiones no-TIR dirigen la localización y regulan la toxicidad. Sin embargo, las proteínas TIR humanas no son tóxicas. Los dominios TIR de BtpA y BtpB, TIRAP y TRAM se disponen en filamentos en levadura, debido a interacciones TIR-TIR, y MyD88 y TRIF se localizan en puntos citosólicos. MyD88 y TIRAP colocalizan, mientras que TRIF y TRAM, aunque interaccionan in vitro, no colocalizan en levadura. El modelo reproduce las interacciones entre los TIR humanos y el dominio TIR de TLR4, incluido el reclutamiento de TIRAP y TRAM a acúmulos en la membrana plasmática. Nuestro modelo evidencia la capacidad de IRAK4, quinasa que actúa posteriormente en la ruta, de fosforilar MyD88 en varios residuos de Ser/Thr. Tanto IRAK1 como IRAK2, interaccionan con TIRAP, independientemente de su BB loop, un motivo estructural implicado en las interacciones TIR-TIR. Los mutantes de TRAM en el BB loop y en D91 E92 no forman filamentos. BtpB y su dominio TIR despolarizan la actina, bloquean la endocitosis e impiden la señalización por MAPK. Un rastreo por sobreexpresión de genes de levadura mostró que ciertas enzimas metabólicas suprimen la toxicidad inducida por BtpB. De hecho, detectamos una caída de los niveles de NAD(+) y ATP que nos permitió confirmar, en BtpA, e identificar por primera vez, en BtpB, su actividad NADasa. El ácido glutámico del motivo WxxxE de los dominios TIR de BtpA y BtpB es esencial para la eliminación del NAD(+) celular y por ende del resto de fenotipos tóxicos, pero no de la formación de filamentos. Otros mutantes encontrados en un rastreo por mutagénesis al azar, aún forman filamentos aunque no son tóxicos, sugiriendo que estas funciones dependen de distintos motivos estructurales. Por último, hemos expresado las proteínas TIR humanas junto a las bacterianas en levadura y visto que las humanas no influyen en la toxicidad de las bacterianas, y que los filamentos de TRAM desaparecen al coexpresar BtpA y BtpB silvestres, de manera dependiente del motivo catalítico. En resumen, S. cerevisiae es un modelo útil para estudiar las proteínas TIR y profundizar en la señalización por SMOCs y las interacciones patógeno-hospedador.

  • English

    Living organisms use efficient systems to detect pathogens, such as the Toll-like receptor (TLR) signaling. Upon recognition of a ligand, TLRs amplify the signal via the formation of Supramolecular Organizing Centers (SMOCs) (Kagan et al., 2014), triggering innate immunity responses. These SMOCs are complexes of proteins sharing protein-protein interaction motifs, namely the Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain. Human TLR4 signals from two SMOCs: myddosome and triffosome (Fitzgerald and Kagan, 2020), containing TIRAP and MyD88 or TRAM and TRIF respectively. TIR proteins are widespread along phylogeny and some of their functions remain obscure. Indeed they are not just sticky domains, but some can enzymatically consume NAD+ (Essuman et al., 2018). They play immunity-related roles in animals and plants, and some pathogenic bacteria produce TIR effectors to subvert host immunity (Spear et al., 2009). Among them, Brucella, an intracellular pathogen, bears two TIR effectors called BtpA and BtpB, both secreted by its Type IV Secretion System. BtpA can degrade NAD+ (Essuman et al., 2018), and together with BtpB, they block mammalian TLR signaling (Salcedo et al., 2013) and stabilize host microtubules (Felix et al., 2014). Saccharomyces cerevisiae is an excellent eukaryotic cell model, having highly conserved mechanisms and a myriad of molecular biology tools available (Khurana and Lindquist, 2010). To date, several yeast models of human disease, e.g. the PIK3/PTEN/Akt1(Coronas-Serna et al., 2020b), or bacterial virulence, e.g. the Samonella effector SopB (Rodríguez-Escudero et al., 2006) have been developed by our research group...