Resumen de Biotechnological production of antioxidan petalains and evaluation of their functional capacity in the in vivo model Caenorhabditis elegans
María Alejandra Guerrero Rubio
- español
Las propiedades antioxidantes, antitumorales y antiinflamatorias de las betalaínas se han estudiado principalmente mediante el uso de extractos de plantas del orden Caryophyllales. La producción y purificación de betalaínas a partir de partes comestibles de las plantas han sido factores limitantes en el análisis de compuestos individuales. Además, la falta de estudios con betalaínas individuales puras ha dificultado la confirmación inequívoca de las betalaínas como compuestos que promueven la salud y la caracterización de las estructuras más activas.
Así, los objetivos de esta Tesis fueron: 1. Búsqueda de fuentes alternativas de dioxigenasas formadoras de ácido betalámico a través de la extracción de enzimas en hospedadores no nativos.
2. Producción biotecnológica de betalaínas individuales mediante la expresión heteróloga de enzimas DODA eficientes en cultivos bacterianos.
3. Construcción y optimización de una máquina para el control automático del tiempo de vida de los gusanos y su aplicación en la caracterización de betalaínas.
4. Análisis de cambios transcripcionales en gusanos tratados con betalaínas y posterior confirmación biológica mediante el uso de cepas mutantes de C. elegans.
Los resultados obtenidos han demostrado que la síntesis de betalaínas no se limita a las plantas. Las dioxigenasas microbianas descritas en esta Tesis Doctoral presentan una mayor actividad y afinidad que las caracterizadas de origen vegetal. Gracias a la actividad superior de la enzima DODA de Gluconacetobacter diazotrophicus, los primeros pasos en la biosíntesis de betalaínas se han establecido por primera vez.
La clonación de esta enzima novedosa y eficiente ha llevado a la puesta en marcha de un sistema de producción biotecnológica de pigmentos individuales que mejoró el rendimiento de las metodologías anteriores. Este novedoso enfoque biotecnológico permitió un estudio más profundo de las propiedades físico-químicas de las betalaínas y la obtención de nuevos compuestos desconocidos como la quitosano-betaxantina, la primera betaxantina polimérica fluorescente que podría combinar las propiedades fluorescentes de las betalaínas y las propiedades del quitosano, un polímero de azúcar ampliamente utilizado con fines médicos.
Además, el análisis de las propiedades de cada betalaína como compuestos bioactivos ahora es posible. Estas propiedades se analizaron utilizando Caenorhabditis elegans, un pequeño nematodo ampliamente utilizado como modelo animal debido a su ciclo de vida rápido y simple y su fácil mantenimiento en el laboratorio.
El tiempo de vida de C. elegans es un parámetro ampliamente utilizado para describir el efecto de diferentes moléculas en el envejecimiento de este modelo animal. Con este propósito, se construyó la máquina "Lifespan Machine", una plataforma automática para el análisis del tiempo de vida. Así, el análisis de diecisiete betalaínas individuales mostró que su consumo prolonga la vida de los gusanos. El mecanismo molecular que subyace a este efecto se analizó utilizando cepas mutantes y realizando ensayos de microarrays a partir de la extracción de ARN de gusanos alimentados con betalaínas. Los resultados mostraron que las betalaínas modulan la expresión de daf-16 o skn-1, genes ortólogos a FOXO y Nrf2 humanos, respectivamente. En ambas especies, estos genes están involucrados en vías relacionadas con la longevidad y la resistencia al estrés oxidativo y conducen a la sobreexpresión de genes hsp que codifican las proteínas HSP involucradas en la resistencia al cáncer y al Alzheimer. Por lo tanto, los resultados obtenidos pueden abrir nuevas líneas de investigación en la búsqueda de tratamientos efectivos basados en estas moléculas de origen vegetal.
Paralelo al tema principal, el dispositivo para el análisis automático del tiempo de vida de C. elegans facilitó el estudio de otros compuestos individuales, tanto naturales como sintéticos. Los efectos que promueven la salud de seis flavonoides estructuralmente relacionadas, así como el daño producido por la administración de seis colorantes alimentarios artificiales, se establecieron mediante el uso de la máquina "Lifespan Machine" y del uso de varias técnicas de microscopía. Además, el análisis de microarrays realizado con gusanos tratados con estos compuestos mostró sus genes diana y cómo el consumo de estos compuestos es capaz de modular vías relacionadas con la longevidad o el estrés oxidativo.
- English
The antioxidant, anti-tumoral and anti-inflammatory properties of betalains have been mainly studied by employing extracts of plants of the order Caryophyllales. Betalains production and purification from edible parts of the plants have been limiting factors in the analysis of individual compounds. In addition, the lack of studies with pure, individual betalains has hindered the unequivocal confirmation of betalains as health-promoting compounds and the characterization of the most active structures.
Thus, the objectives of this Thesis were: 1. Searching for alternative sources of betalamic acid-forming dioxygenases through enzyme-mining in non-native hosts.
2. Biotechnological production of individual betalains by heterologous expression of efficient DODA enzymes in bacterial cultures.
3. Construction and optimization of a machine for the automatic control of worms' lifespan and its application to the characterization of betalains.
4. Analysis of transcriptional changes in worms treated with betalains and subsequent biological confirmation by using mutant strains of C. elegans.
The results obtained have shown that the synthesis of betalains is not restricted to plants. Microbial dioxygenases described in this Thesis present higher activity and affinity that those characterized from plants. Thanks to the superior activity of the DODA enzyme from Gluconacetobacter diazotrophicus, the early steps in the biosynthesis of betalains have been established for the first time.
The cloning of this novel and efficient enzyme has led to the start-up of a biotechnological production system of individual pigments which improved the yield of previous methodologies. This novel biotechnological approach afforded a deeper study of the physical-chemical properties of betalains and the obtention of novel, unknown compounds such as chitosan-betaxanthin, the first fluorescent polymeric betaxanthin which might combine the fluorescent properties of betalains and the properties of chitosan, a sugar polymer widely used with medical purposes.
In addition, the analysis of the properties of each betalain as bioactive compounds is now possible. These properties were analyzed using Caenorhabditis elegans, a small nematode widely used as animal model due to its fast, simple life cycle and its easy maintenance in the laboratory.
Lifespan of C. elegans is a parameter widely used to describe the effect of different molecules in the aging of this animal model. With this purpose, Lifespan Machine, an automatic platform for the lifespan analysis was built. Thus, analysis of seventeen individual betalains showed that their consumption increases the lifespan of worms. The molecular mechanism underlying this effect was analyzed by using mutant strains and by performing microarray assays from the extraction of RNA from worms fed with betalains. The results showed that betalains modulate the expression of daf-16 or skn-1, orthologous genes to human FOXO and Nrf2, respectively. In both species, these genes are involved in pathways related to longevity and oxidative stress resistance and lead to the overexpression of hsp genes that encode HSP proteins involved in resistance to cancer and Alzheimer's. Therefore, the results obtained can open new lines of research in the search for effective treatments based on these molecules of plant origin.
Parallel to the main topic, the device for the automatic analysis of C. elegans lifespan facilitates the study of other individual compounds, both natural and synthetic, in vivo in the animal model for the first time. Thus, the health-promoting effects of six flavonoids structurally related as well as the damage produced by the administration of six artificial food dyes were highlighted by using the Lifespan Machine and several techniques of microscopy. In addition, microarray analysis performed with worms treated with these compounds showed their target genes and how their consumption is able to modulate pathways related to longevity or oxidative stress.
