Aplicación de técnicas microbiológicas y químicas para la recuperación de suelos contaminados por plaguicidas e hidrocarburos aromáticos policíclicos: evaluación de su viabilidad mediante estudios de biología molecular y ecotoxicidad

• Autores: Alba Lara Moreno
• Directores de la Tesis: Francisco Merchán Ignacio (dir. tes.), Jaime Villaverde Capellán (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2021
• Idioma: español
• Número de páginas: 310
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Idus
• Resumen
  • español

    En la actualidad existe un interés creciente por los métodos de recuperación biológicos de suelos contaminados, presentándose la biorrecuperación como una alternativa a los métodos convencionales (landfilling, incineración o descomposición química). Se trata de una herramienta respetuosa con el medio ambiente, de bajo coste y no invasiva, que utiliza organismos vivos para detoxificar las sustancias de riesgo para el hombre y el medio ambiente. Por este motivo, en este estudio para conseguir la recuperación de suelos contaminados se han llevado a cabo ensayos de biodegradación y mineralización en medio acuoso, en suspensiones suelo-agua y en suelo. Los contaminantes orgánicos estudiados en este trabajo fueron: cinco herbicidas pertenecientes a la familia química de las fenilureas (diurón, linurón, isoproturón, clortolurón y fluometurón), otro herbicida de la familia de las dinitroanilinas (trifluralina), un insecticida organofosforado (clorpirifós), así como hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) de bajo y alto peso molecular. Cuando la biodegradación no se puede llevar a cabo de forma natural debido a que los microorganismos no disponen de los nutrientes esenciales para ello en la zona contaminada, o no presentan las herramientas metabólicas necesarias para actuar sobre un determinado contaminante, se requiere de la intervención mediante actuaciones encaminadas a fomentar la actividad microbiológica, siendo necesario recurrir a la biodegradación asistida a través del empleo de dos posibles técnicas: bioestímulo (mediante la adición de nutrientes) y bioaumento (inoculando microorganismos de origen endógeno y/o exógeno). Los macro y micronutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano suelen estar presentes en el suelo en cantidades demasiado bajas, provocando una limitación para la actividad microbiana, de ahí la necesidad de emplear una solución de nutrientes que actúe como estimulante de los microorganismos degradadores presentes en el suelo. Los microrganismos usados como degradadores específicos se obtienen mediante cultivos de enriquecimiento de suelos que han estado en contacto con el contaminante durante un largo periodo de tiempo. La microbiota del suelo se expone a una elevada concentración de contaminante, facilitando de esta forma el crecimiento de aquellos microorganismos que presentan la capacidad de usar como fuente de carbono y energía al contaminante orgánico en cuestión. Los procesos de recuperación de suelos contaminados por compuestos orgánicos como plaguicidas y PAHs están a menudo muy limitados a consecuencia de sus propiedades físicoquímicas, baja solubilidad, elevado kow y koc, estructura aromática, grupos halogenados, etc. Estas propiedades hacen que la fracción biodisponible del contaminante en el suelo sea muy baja y, por lo tanto, sean sustancias recalcitrantes mostrando una elevada persistencia. Con el fin de mejorarla, en el presente estudio se han empleado ciclodextrinas, oligosacáridos cíclicos que, gracias a su capacidad para formar complejos de inclusión con compuestos orgánicos hidrofóbicos, son capaces de incrementar su solubilidad en agua y en consecuencia su biodisponibilidad. El descenso de la concentración inicial del contaminante no implica la no formación y acumulación de metabolitos tóxicos, lo que haría replantear la aplicación o no de una determinada técnica de biorrecuperación. Por lo que, ensayos de ecotoxicidad han sido realizados al inicio y al final de los tratamientos aplicados en el presente trabajo, mediante la monitorización de la bioluminiscencia natural de la bacteria Vibrio fisheri (Microtox®), con el fin de evaluar la eficacia y seguridad de la estrategia de descontaminación empleada y por lo tanto su viabilidad. Los estudios de biología molecular llevados a cabo han ayudado igualmente, a evaluar la viabilidad de las técnicas de biorrecuperación empleadas. Gracias al empleo de distintas técnicas de biología molecular se ha conseguido, por un lado, identificar las cepas bacterianas aisladas y seleccionadas como degradadoras de los distintos contaminantes orgánicos estudiados mediante la secuenciación del ARN ribosómico 16S, y por otro lado, secuenciar el genoma de la cepa bacteriana seleccionada y describir la ruta de degradación de fenantreno que utiliza, gracias a la identificación de los metabolitos formados y de los genes que codifican las enzimas responsables de llevar a cabo la ruta de degradación, mediante una amplia búsqueda bibliográfica y un análisis exhaustivo de la anotación del genoma bacteriano empleando diversas bases de datos. Para la confirmación de la presencia de estos genes degradadores en el genoma bacteriano, se emplearon herramientas bioinformáticas (BLAST, Clustal Omega, etc.) que nos permitieron alinear la secuencia del gen con el genoma de la cepa bacteriana estudiada (Stenotrophomonas maltophilia CPHE1), confirmando la posibilidad de la presencia de dicho gen en la bacteria de estudio. Por último, una vez identificados los genes implicados, se estudió su expresión empleando la Reacción en Cadena de la Polimerasa Reversa (RT-PCR), confirmando así la posible ruta de degradación propuesta.

  • English

    Nowadays, there is a growing interest in using biological remediation methods to recuperate polluted soils, being bioremediation an alternative to conventional methods (landfilling, incineration or chemical decomposition). It is an environmentally friendly, low-cost, noninvasive tool that uses living organisms to detoxify substances which pose a risk for humans and the environment. For this reason, in this study biodegradation and mineralization assays in aqueous medium, soil-water suspensions and soil have been carried out to achieve the bioremediation of contaminated soils. The organic contaminants studied in this work were: five herbicides belonging to the chemical family of phenylureas (diuron, linuron, isoproturon, chlorotoluron and fluometuron), one herbicide belonging to the dinitroaniline family (trifluralin), an organophosphate insecticide (chlorpyrifos) and low- and high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). When biodegradation of a pollutant cannot occur naturally because microorganisms do not have the essential nutrients for it in the contaminated area, or do not have the necessary metabolic tools to act on a particular pollutant, intervention is required through actions designed to promote microbiological activity, assisting the biodegradation process through the use of two different techniques: biostimulation (by adding nutrients) and bioaugmentation (inoculating endogenous and/or exogenous microorganisms). The macro and micronutrients needed for bacterial development are usually present in soil in very small amounts, causing a limitation for microbial activity, and therefore, it is essential the use of a nutrient solution that acts as stimulant for the degrading microorganisms present in soil. Microorganisms used as specific degraders are isolated through enrichment cultures using soils that have been in contact with the pollutant for a long period of time. Soil microbiota is exposed to a high concentration of contaminants, thus facilitating the growth of those microorganisms that present the ability to use the organic pollutant in question as source of carbon and energy. Recuperation processes of soils contaminated by organic compounds such as pesticides and PAHs are often very limited due to their physical-chemical properties, low solubility, high kow and koc, aromatic structure, halogenated groups, etc. These properties together make the bioavailable fraction of the contaminant in the soil very low, leading to the production of recalcitrant substances which show high persistence. In order to improve it, cyclodextrins have been used in this study since they are cyclic oligosaccharides with the ability to form inclusion complexes with hydrophobic organic compounds, being able to increase their solubility in water and consequently their bioavailability. The decreasing of the initial contaminant concentration does not involve the no formation or accumulation of toxic metabolites, what would make to reconsider the application or not of a particular bioremediation technique. Ecotoxicity tests have been carried out at the beginning and at the end of the treatments applied in this work, by monitoring the natural bioluminescence of the bacterium Vibrio fisheri (Microtox®), in order to evaluate the efficacy and safety of the decontamination strategy used and hence, its viability. Molecular biological studies have also helped to assess the feasibility of the bioremediation techniques employed. As a result of using different molecular biological techniques, it has been possible, on the one hand, to identify the bacterial strains isolated and selected as specific degraders for the studied pollutants by sequencing the ribosome RNA 16S, and on the other hand, to sequence the genome of the selected bacterial strain and describe the phenantrene degradation pathway used, thanks to the identification of the metabolites formed and the genes that encode the enzymes responsible for the degradation route, through an extensive bibliographic search and the analysis of bacterial genome annotation using various databases. For confirmation of the presence of these degrading genes in the bacterial genome, bioinformatics tools (BLAST, Clustal Omega, etc.) were employed to allow us to align the gene sequence with the studied genome (Stenotrophomonas maltophilia CPHE1), validating the possibility of the presence of such gene in the bacteria studied. Finally, once the genes involved were identified, their expression was studied using the Reverse Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), thus confirming the possible proposed biodegradation pathway.