Estudio del papel de las exoproteasas apra y lasb en las infecciones por pseudomonas aeruginosa
- Autores: Margalida Mateu Borràs
- Directores de la Tesis: Sebastián Albertí Serrano (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de les Illes Balears ( España ) en 2020
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Rafael Cantón Moreno (presid.), Antonio Oliver Palomo (secret.), María Cristina Vega Fernández (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Microbiología Ambiental y Biomédica por la Universidad de las Illes Balears
- Materias:
- Texto completo no disponible (Saber más ...)
- Resumen
- español
Introducción: Pseudomonas aeruginosa es uno de los microorganismos Gram negativos que más frecuentemente causa bacteriemias nosocomiales. Por otro lado, también produce infecciones respiratorias crónicas, siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en pacientes con fibrosis quística. El sistema del complemento juega un papel importante en la respuesta inflamatoria y es clave para combatir las infecciones por este patógeno, por lo que no es extraño que P.
aeruginosa haya desarrollado mecanismos que permiten eludirlo, como la producción de proteasas que degradan directamente sus componentes. P.
aeruginosa produce dos exoproteases principales, la elastasa LasB y la proteasa alcalina AprA. La capacidad de estas exoproteasas para degradar algunas proteínas del sistema del complemento ha sido demostrada in vitro utilizando componentes purificados. Sin embargo, su papel en las infecciones causadas por P. aeruginosa es poco conocido. Por este motivo, el objetivo general de esta tesis doctoral fue estudiar el papel de las exoproteasas AprA y LasB en las infecciones por Pseudomonas aeruginosa.
Contenido de la investigación: En una primera parte del trabajo, se estudio la contribución de AprA y LasB en la patogénesis de las infecciones del torrente sanguíneo causadas por P. aeruginosa. Para ello, se utilizó un set de mutantes isogénicos deficientes en AprA, LasB o ambas proteasas. Nuestros resultados demostraron que éstas son las dos únicas exoproteasas de P. aeruginosa capaces de degradar el componente C3 del complemento, tanto en forma soluble como unido a la superficie bacteriana. Sin embargo, en los primeros instantes de la interacción complemento-bacteria, el déficit de estas proteasas no tuvo ningún efecto sobre la opsonización por C3 de la bacteria, ni sobre su capacidad para evadir la muerte por opsonofagocitosis. Por otra parte, los experimentos in vivo utilizando modelos murinos de infección sistémica revelaron que la perdida de AprA y LasB no atenúa la la virulencia del microorganismo. Finalmente, tampoco encontramos ninguna asociación entre la capacidad de degradar C3 y la habilidad de desarrollar una infección letal en una colección de 188 aislados clínicos procedentes de bacteriemias.
En la segunda parte, investigamos la contribución de AprA y LasB en la intensa inflamación pulmonar característica de los pacientes con fibrosis quística. Mediante el análisis de un conjunto de aislados obtenidos de infecciones pulmonares agudas y crónicas demostramos que los aislados de infecciones crónicas inducen la producción de elevados niveles de C5a que se van acumulando debido a la pérdida de las exoproteasas AprA y LasB responsables de la escisión de C5a. Además, observamos que la incapacidad de degradar C5a exhibida por los aislados procedentes de pacientes con fibrosis quística se debe a mutaciones en la proteína reguladora LasR.
De esta forma, la complementación de un aislado incapaz de degradar C5a con un la proteína LasR funcional restauró su capacidad de degradar C5a presente en el fluido broncoalveolar humano.
Conclusiones: Las proteasas AprA y LasB, confieren a P. aeruginosa la capacidad para degradar C3, pero no contribuyen a la virulencia en un modelo murino de infección sistémica por P. aeruginosa y no son buenos marcadores para el pronóstico de la mortalidad en las infecciones del torrente sanguíneo causadas por este microorganismo.
Por otra parte, en las infecciones respiratorias crónicas, la pérdida de la capacidad de degradar C5a es debida a mutaciones en el regulador LasR. Este fenotipo, adquirido en el proceso de adaptación de P. aeruginosa al pulmón con fibrosis quística, puede ser el responsable de la acumulación de C5a y de la disfunción generalizada de los neutrófilos que predispone al aumento de la inflamación y la reducción en la capacidad para eliminar las bacterias descrito en pacientes con fibrosis quística.
- català
Introducció: Pseudomonas aeruginosa és un dels microorganismes Gram negatius que més freqüentment causa bacterièmies nosocomials. Per altra banda, també produeix infeccions respiratòries cròniques, essent la principal causa de morbiditat i mortalitat en pacients amb fibrosi quística. El sistema del complement juga un paper important en la resposta inflamatòria i és clau per a combatre les infeccions per aquest patogen, per la qual cosa no és estrany que P. aeruginosa hagi desenvolupat mecanismes que permeten defugir-lo, com la producció de proteases que degraden directament els seus components. P. aeruginosa produeix dues exoproteases principals, l’elastasa LasB i la proteasa alcalina AprA. La capacitat d’aquestes exoproteases per degradar algunes proteïnes del sistema del complement ha sigut demostrada in vitro utilitzant components purificats. No obstant, el seu paper en les infeccions causades per P. aeruginosa és poc conegut. Per aquest motiu, l’objectiu general d’aquesta tesi doctoral va ser estudiar el paper de les exoproteases AprA i LasB en les infeccions per P. aeruginosa.
Contingut de la recerca: En una primera part del treball, es va estudiar la contribució d’AprA i LasB en la patogènesi de les infeccions del torrent sanguini causades per P.
aeruginosa. Per a això, es va utilitzar un set de mutants isogènics deficients en AprA, LasB o ambdues proteases. Els nostres resultats van demostrar que aquestes són les dues úniques exoproteases de P. aeruginosa amb capacitat de degradar el component C3 del complement, tan en forma soluble com unit a la superfície bacteriana. No obstant, en els primers moments de la interacció complement-bacteri, el dèficit d’aquestes proteases no va tenir cap efecte sobre l'opsonització per C3 de la bactèria, ni sobre la seva capacitat d’evadir la mort per opsonofagocitosi. Per altra banda, els experiments in vivo utilitzant models murins d’infecció sistèmica van revelar que la pèrdua d’AprA i LasB no atenua la virulència del microorganisme.
Finalment, tampoc es va trobar cap associació entre la capacitat de degradar C3 i l’habilitat de desenvolupar una infecció letal en una col·lecció de 188 aïllats clínics obtinguts de bacterièmies.
En la segona part, es va investigar la contribució d’AprA i LasB en la intensa inflamació pulmonar característica dels pacients amb fibrosi quística. Mitjançant l’anàlisi d’un conjunt d’aïllats obtinguts d’infeccions pulmonars agudes i cròniques es va demostrar que els aïllats d’infeccions cròniques indueixen la producció de nivells elevats de C5a que es van acumulant degut a la pèrdua d’AprA i LasB, les úniques exoproteases responsables de l'escissió de C5a. A més a més, es va observar que la incapacitat de degradar C5a exhibida pels aïllats provinents de pacients amb fibrosi quística es deu a mutacions en la proteïna reguladora LasR. D’aquesta forma, la complementació d’un aïllat incapaç de degradar C5a amb una proteïna LasR funcional restaurà la seva capacitat de degradar C5a present en el flux broncoalveolar humà.
Conclusions: Les proteasas AprA i LasB, confereixen a P. aeruginosa la capacitat per a degradar C3, però no contribueixen a la virulència en un model murí d'infecció sistèmica per P. aeruginosa i no són bons marcadors per al pronòstic de la mortalitat en les infeccions del torrent sanguini causades per aquest microorganisme.
D'altra banda, en les infeccions respiratòries cròniques, la pèrdua de la capacitat de degradar C5a és deguda a mutacions en el regulador LasR. Aquest fenotip, adquirit en el procés d'adaptació de P. aeruginosa al pulmó amb fibrosi quística, pot ser el responsable de l'acumulació de C5a i de la disfunció generalitzada dels neutròfils que predisposa a l'augment de la inflamació i la reducció en la capacitat per a eliminar els bacteris descrit en pacients amb fibrosi quística.
- English
Introduction: Pseudomonas aeruginosa is one of the most common Gram-negative microorganisms associated with nosocomial bacteremia as well as the leading cause of morbidity and mortality in chronic lung infections in patients with cystic fibrosis.
The complement system plays an important role in the host inflammatory response and is essential to combat P. aeruginosa infections. Thus, it is not surprising that this pathogen has developed mechanisms to evade the attack by this system, including the production of proteases with the ability to cleave complement proteins. P.
aeruginosa secretes two major proteases, elastase LasB and alkaline protease AprA.
In vitro experiments using purified proteases have shown that both proteases have the ability to cleave some complement components. However, the impact of both proteases on the virulence of P. aeruginosa infections remains poorly investigated. In this doctoral thesis, we studied the contribution of the exoproteases AprA and LasB to the virulence of P. aeruginosa infections.
Research content: In the first part of this work, we used isogenic mutant strains deficient in AprA, LasB or both to investigate the contribution of AprA and LasB to the pathogenesis of P. aeruginosa bloodstream infections. We demonstrated that AprA and LasB are unique and sufficient to cleave the complement component C3, either soluble or deposited on the bacteria. However, in the initial interaction complementbacteria, lack of these exoproteases had no effect on C3 opsonization and resistance to opsonophagocytic killing of P. aeruginosa. Furthermore, AprA or LasB deficiency did not attenuate the virulence of P. aeruginosa in a murine model of systemic infection. Finally, no association was found between the C3-cleaving phenotype of 188 P. aeruginosa bloodstream infection isolates and the outcome of the infection.
In the second part, we investigated the contribution of AprA and LasB to the intense airway inflammatory response observed in cystic fibrosis patients. The production of C5a by P. aeruginosa isolates from patients with acute or chronic airway infection was determined. We demonstrated that isolates from airway chronic infections induce exuberant C5a production that accumulates due to the loss of the exoproteases AprA and LasB, responsible of C5a cleavage. We observed that in isolates from chronically infected cystic fibrosis patients, lack of the bacterial protease-dependent C5a degradation is due to mutations in the regulatory protein LasR. Thus, complementation of a non-C5a-cleaving cystic fibrosis isolate with wild type LasR restored its ability to cleave C5a from human bronchoalveolar fluid.
Conclusions: AprA and LasB, confer to P. aeruginosa the capacity to cleave C3, but they do not contribute to the virulence phenotype in a mice model of systemic infection and are poor prognostic markers of mortality in bloodstream infections.
- español
