Evaluación in vitro de la inducción proliferativa de organoclorados y de sus mezclas, mediante la aplicación del ensayo E-Screen
- Autores: María Paz Aldeguer Aldeguer
- Directores de la Tesis: Emma Martínez López (dir. tes.), Antonio Juan García Fernández (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Murcia ( España ) en 2018
- Idioma: español
- Número de páginas: 305
- Tribunal Calificador de la Tesis: Rosario Moyano Salvago (presid.), Silvia Espín Luján (secret.), Octavio Pérez Luzardo (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biodiversidad y Gestión Ambiental por la Universidad de Murcia
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: DIGITUM
- Resumen
- español
Los compuestos tóxicos, persistentes y bioacumulables son de gran interés en la evaluación de riesgos para la salud del ser humano y de las especies animales. Entre ellos, destaca el interés por los pesticidas organoclorados y los bifenilospoliclorados (PCB). Su presencia ha sido continua durante décadas en todos los niveles de las cadenas tróficas; sin embargo, el interés es creciente en las especies ubicadas en las partes más altas de las cadenas alimentarias (incluido el ser humano), pues son integradores de la exposición en los eslabones inferiores. Las grandes especies de rapaces se ubican en las partes más altas de sus redes tróficas, al mismo nivel que el ser humano, siendo así consideradas muchas de ellas, ideales centinelas de riesgos ambientales.
Estudios previos de biomonitorización de pesticidas organoclorados y PCB realizados en diversas especies de rapaces por el grupo de investigación de Toxicología de la Universidad de Murcia habían detectado de forma continua presencia este tipo de contaminantes (entre otros) en sangre y otras muestras de estas aves. Sin embargo, la presencia de un compuesto en un ser vivo no es suficiente para explicar efectos deletéreos o indeseables en ellos. Por otro lado, estos compuestos han sido ampliamente estudiados por su potencial efecto perturbador endocrino; quedando aún lagunas sobre ciertos efectos y las condiciones de exposición (dosis, mezclas, etc).
El objetivo de este trabajo es el estudio in vitro de la alteración de la proliferación celular, parámetro vinculado a la actividad estrogénica y englobada en la función endocrina, sobre la línea celular MCF-7 por la exposición a concentraciones subletales de 14 pesticidas y 4 PCB y 8 de sus mezclas más frecuentemente observadas en estudios de biomonitorización en rapaces. Para ello, se aplicó el ensayo E-Screen, ensayo in vitro de proliferación celular sobre la línea MCF-7 (Soto et al., 1994, 1995) para la exposición a dichos organoclorados frecuentemente monitorizadas en grandes rapaces. El E-Screen es un ensayo de 6 días de duración que emplea la línea celular MCF-7, capaz de expresar endógenamente receptores estrogénicos sobre los que pueden actuar ciertos perturbadores endocrinos. Se estudió representantes de los siguientes grupos: difenilalifáticos (p,p'-DDT, p,p'-DDE, p,p'-DDD y dicofol), ciclodiénicos (aldrín, dieldrín, endrín, endrín aldehído, endosulfán??, endosulfán sulfato, heptacloro y heptacloro epóxido), hexaclorociclohexanos o HCH (?-HCH y lindando técnico) y PCB (PCB# 118, PCB# 126, PCB# 153, y PCB# 180). En cuanto a las ocho mezclas diseñadas en base a los estudios de campo previos, se agrupan en mezclas binarias[MB h/c/: lindano técnico+ endosulfán ?? (50:50); MB d/d/: p,p'-DDT+p,p'-DDE (50:50); MBc/d/1/: endosulfán ??+p,p'-DDE (75:25); MB c/d/2/:endosulfán ?? +p,p'-DDT (75:25)] mezclas ternarias [MT c/d/d/: endosulfán ?? + p,p'-DDT + p,p'-DDE (75:12,5:12,5); MT h/d/d/ :lindano técnico + p,p'-DDT + p,p'-DDE (75:12,5:12,5)], una mezcla cuaternaria [MC c/c/d/d/: aldrín + dieldrín + p,p'-DDT + p,p'-DDE (25:25:25:25)] y una senaria [{MS c/c/c/d/d/h/: endosulfán ??+aldrín + dieldrín + p,p'-DDT + p,p'-DDE + lindano técnico (50:12,5:12,5:6,25:6,25:12,5)]. Se abarcó un rango de 7 concentraciones (desde 1,0-5M hasta 1,0E-11M para los compuestos individuales, variando en las mezclas hasta 3,0E-13M en algunos casos), empleando como control positivo el 17?-estradiol y DMSO como solvente. En función del efecto proliferativo relativo (RPE) obtenido, se clasificó cada compuesto y mezcla según la categorización pre-establecida en la bibliografía como débilmente estrogénicos, parcial y fuertemente estrogénicos (RPE< 25%, entre el 25 y el 75 %, y > al 75%, respectivamente).
Los análisis de los compuestos evaluados individualmente, revelaron que todos ellos dieron lugar a una intensa proliferación celular, puesto que no se detectaron efectos débilmente estrogénicos. Las concentraciones 1,0E-9M y 1,0E-8M fueron las responsables del máximo efecto observado en la mayoría de los análisis. El ciclodiénicoaldrín fue el OC que indujo mayor proliferación, tanto de los ensayos individualizados como de las mezclas. Por otro lado, al menos una concentración de cada uno de los difenilalifático se catalogó como fuertemente estrogénico, en contraposición con los HCH, ya que tan sólo el lindano técnico demostró ser fuertemente estrogénico. Los PCB se caracterizaron por la diversidad de respuesta, pudiendo aparecer valores por debajo del control negativo y fuertemente estrogénicos en el mismo producto.
En cuanto a las mezclas, destaca el menor RPE respecto a los análisis individuales. Entre las mezclas binarias se encuentra la mezcla más proliferativa y la de menor efecto. Por su parte, la mezcla más compleja (conformada por 6 compuestos) dio lugar a un RPE máximo del 33%. Asimismo, se comprobó que el efecto de las mezclas, no siempre se igualaba al de sus integrantes a pesar de que pudieran estar compuestos mayoritariamente por OC fuertemente estrogénicos.
Con carácter general, se observó una variación del efecto sin un patrón definido a lo largo del rango analizado, por lo que un compuesto/mezcla puede ser catalogado de distinta manera en función de la concentración escogida. Este hecho, dificulta la comparación de datos entre estudios, ya que no siempre se dispone de toda la iformación deseable. Los resultados de este trabajo aportan luz sobre el efecto estrogénico inducido por la exposición a organoclorados y diferentes mezclas ambientalmente posibles; sin embargo, es preciso profundizar aún más en los potenciales efectos estrogénicos de las mezclas y los mecanismos que los explican.
- English
Bioaccumulable, persistent, toxic compounds are of particular interest when assessing risks to the health of humans and animal species. Of these compounds, organochloride pesticides and polychlorinated biphenyls (PCB) stand out as especially interesting. They have been continuously present for decades in all levels of the trophic chain, although there is a growing interest in species in the upper links of the food chain (including human beings), as they integrate the exposure of the lower links. The large species of birds of prey are at the top of their food webs, on the same level as human beings, and many of them are therefore considered to be ideal sentinels of environmental risks.
Previous bio-monitoring studies of organochloride pesticides and PCBs carried out on different species of birds of prey by the research group of the University of Murcia Toxicology Department had detected a continuous presence of this type of contamination (among others) in blood and other samples taken from these birds. However, the mere presence of a compound in a living organism is not enough to explain any harmful and undesirable effects in it. These compounds have also been widely studied in relation to their potential endocrine-disrupting effect; and there are still some gaps in our understanding of certain effects and the conditions of exposure (dose, mixtures, etc.).
The aim of this thesis is the in vitro study of the alteration of cell proliferation, a parameter linked to oestrogenic activity and encompassed by the endocrine function, on the MCF-7 cell line due to exposure to sub-lethal concentrations of 14 pesticides, 4 PCB and 8 mixtures of them most commonly observed in bio-monitoring studies of birds of prey. To do this, we used the E-Screen assay, an in vitro assay of the cell proliferation on the MCF-7 cell line for the exposure to the aforementioned organochlorides frequently monitored in large birds of prey. The E-Screen is a 6-day assay that employs the MCF-7 cell line, which is able to endogenously express the oestrogen receptors on which certain endocrine-disruptors act. Representatives of the following groups were studied: Diphenyl aliphatics (p,p'-DDT, p,p'-DDE, p,p'-DDD and dicofol), cyclodienes (aldrin, dieldrin, endrin, endrin aldehyde, endosulfan ??, endosulfan sulphate, heptachlor and heptachlor epoxide), hexachlorocyclohexane or HCH (?-HCH and technical lindane) and PCB (PCB# 118, PCB# 126, PCB# 153, and PCB# 180). The eight mixtures designed as a result of the prior field studies are grouped in binary mixtures [MB h/c/: technical lindane + endosulfan ?? (50:50); MB d/d/: p,p'-DDT+p,p'-DDE (50:50); MBc/d/1/: endosulfan ??+p,p'-DDE (75:25); MB c/d/2/:endosulfan ?? +p,p'-DDT (75:25)] ternary mixtures [MT c/d/d/: endosulfan ?? + p,p'-DDT + p,p'-DDE (75:12,5:12,5); MT h/d/d/:technical lindane + p,p'-DDT + p,p'-DDE (75:12,5:12,5)], a quaternary mixture [MC c/c/d/d/:aldrin + dieldrin + p,p'-DDT + p,p'-DDE (25:25:25:25)] and a senary one [{MS c/c/c/d/d/h/: endosulfan ??+aldrin + dieldrin + p,p'-DDT + p,p'-DDE + technical lindane (50:12,5:12,5:6,25:6,25:12,5)]. A range of 7 concentrations was covered (from 1.0-5M to 1.0E-11M for the individual compounds, with the mixtures varying up to 3.0E-13M in some cases), employing as a positive control 17?-oestradiol and DMSO as a solvent. Depending on the relative proliferative effect (RPE) obtained, each compound and mixture was classified according to the categories pre- established in the literature as weakly oestrogenic, partially oestrogenic and fully oestrogenic (RPE < 25%, between 25 and 75 %, and > 75%, respectively).
The analysis of the compounds assessed individually revealed that all of them led to an intense cell proliferation, as no weak oestrogenic effects were detected. The 1.0E-9M and 1.0E-8M concentrations were responsible for the maximum effect observed in most of the analyses. The aldrin cyclodiene was the OC that induced the greatest proliferation, both in the individual assays and the mixtures. At least one concentration of each of the diphenyl aliphatics was categorised as fully oestrogenic, unlike the HCH, as only the technical lindane was demonstrated to be fully oestrogenic. The PCBs were characterised by the diversity of their responses - the values could be below the negative control and be fully oestrogenic.
As regards the mixtures, we can highlight the lower RPE in relation to the individual analyses. Among the binary mixtures we find the most proliferative mixture and the least effect. The most complex mixture (comprising 6 compounds) resulted in a maximum RPE of 33%. It was also observed that the effect of the mixtures was not always equal to that of their integral parts, in spite of the fact they could be mostly made up of fully oestrogenic OCs.
In general, we observed a variation of the effect without a defined pattern throughout the range analysed, which means a compound/mixture can be categorised differently depending on the chosen concentration. This fact makes it more difficult to compare the data of different studies, as the information required is not always available. The results of this study throw light on the oestrogenic effect induced by exposure to organochlorides and different possible environmental mixtures. However, a more in-depth study needs to be made of the potential oestrogenic effects of mixtures and the mechanisms that explain them.
- español
