Resumen de Función de la tiorredoxina (TRXo1) mitocondrial y nuclear: avances en su implicación en señalización y estrés salino
Antonio María Sánchez Guerrero
- español
Las tiorredoxinas (TRXs) son componentes clave para el control redox del metabolismo de las plantas, siendo pequeñas proteínas ubicuas que albergan un dominio activo ditiol involucrado en el intercambio tiol/disulfuro con el que regulan estructura y actividad de proteínas diana. Las TRXs extraplastidiales incluyen el tipo TRXo1 localizado en las mitocondrias y en núcleo, con un papel mucho menos conocido que el de sus homólogas cloroplastídicas.
En esta Tesis Doctoral, con el fin de obtener más información sobre la función fisiológica y metabólica de la tiorredoxina de doble localización TRXo1, analizamos algunos procesos en los que están involucradas proteínas diana tanto mitocondriales como nucleares, así como los cambios metabólicos en los genotipos de Arabidopsis salvaje (WT), knockout (KO) y sobre-expresante (OEX) de Attrxo1 bajo condiciones de estrés salino (100 mM NaCl).
Analizando mitocondrias aisladas comprobamos que los mutantes KO mostraron alteraciones en las actividades de los componentes del ciclo ascorbato-glutatión y en la partición electrónica respiratoria in vivo hacia las vías citocrómica (COX) y alternativa (AOX, diana de TRXo1), así como en el patrón de isoenzimas AOX, lo que indica una reorganización de los diferentes sistemas antioxidantes y respiratorios en salinidad. Además, la disminución de los niveles de glucosa y fructosa en estos mutantes coincidió con un aumento de la respiración a través de COX en condiciones control.
Tras la identificación de la proteína PYR1 (Pyrabactin Resistance 1) receptora de ácido abscísico (ABA) como posible diana de TRXo1 en el núcleo, en esta Tesis hemos corroborado la interacción de ambas proteínas mediante ensayos in vitro (dot-blot trampa y co-inmunoprecipitación), así como in vivo (complementación bimolecular fluorescente).Además, el análisis in vitro de actividad PYR ha evidenciado la regulación redox por TRXo1 de este receptor. Paralelamente, se ha realizado un estudio para evaluar la sensibilidad de los mutantes KO y OEX a diferentes concentraciones de ABA exógeno, analizando el movimiento estomático yla capacidad de germinación. Las diferencias encontradas entre el genotipo WT y los mutantes han mostrado la posible participación de la TRXo1 en la regulación deambos procesos, que podría responder entre otros aspectos, a su interacción con PYR1.
A fin de analizar el efecto que pueda tener la falta y sobre-expresión de TRXo1 sobre procesos derivados del funcionamiento estomático como es el de la fotosíntesis, se ha estudiado en los mutantes su respuesta fotosintética, metabólica y estomática. Se han observado diferencias entre los genotipos tanto en condiciones control como salinas, en términos de desarrollo y movimiento estomático donde la TRXo1 parece estar implicada, tales como una menor densidad de estomas maduros en plantas KO en control y en plantas KO y OEX en salinidad.En cuanto a la apertura estomática, los contenidos elevados de NO y ABA de los mutantes en condiciones salinas, no se reflejaron en un mayor cierre estomático, lo que podría responder a procesos de regulación por modificaciones post-traduccionales sobre elementos de la ruta de señalización de ABA en la que podría estar implicada la TRXo1, como es la percepción de la hormona. Por otro lado, no descartamos la influencia en la dinámica estomática de los cambios metabólicos producidos en ambos mutantes por la alteración en los contenidos en TRXo1.Estos cambios sin embargo no afectan la respuesta fotosintética, que es similar en los tres genotipos.
Los objetivos alcanzados en esta Tesis Doctoral suponen un avance en el estudio de la función fisiológica y metabólica de la TRXo1, profundizando en el conocimiento de sus funciones mitocondriales y nucleares, demostrando su implicación en procesos como el desarrollo estomático y la respuesta a ABA, ambos clave en la adaptación al estrés salino.
- English
Thioredoxins (TRXs) are key components for the redox control of plant metabolism, being small ubiquitous proteins that house an active dithiol domain involved in the thiol / disulfide exchange by which they regulate the structure and activity of target proteins. Extraplastidial TRXs include the TRXo1 type located in the mitochondria and in the nucleus. To date, the knowledge about TRXo1 type is very scarce, compared with their chloroplastid counterparts.
In order to obtain more information on the physiological and metabolic function of the double-localized thioredoxin TRXo1, in this Doctoral Thesis, we have analyzed some processes in which both mitochondrial and nuclear target proteins are involved, as well as metabolic changes in the Knockouts (KO1 and KO2) and in the over-expressing (OEX) Attrxo1 mutants genotypes under saline stress conditions (100 mM NaCl).
In purified mitochondria, we found that the KOs mutants showed alterations in the activities of the ascorbate-glutathione cycle components and in the in vivo electron partitionic between the cytochrome (COX) and alternative (AOX, target of TRXo1) pathways, as well as in the AOX isoenzyme pattern. These results indicate a reorganization of the different antioxidant and respiratory systems under salinity condition. Additionally, we found a decrease in glucose and fructose levels in these mutants, which is consistent with an increase in respiration through COX under control conditions.
PYR1 (Pyrabactine resistance 1) protein, an abscisic acid receptor (ABA), has been found in our laboratory to be a possible target of TRXo1 in the nucleus. In this Doctoral Thesis we have confirmed the interaction between the two proteins by in vitro and in vivo assays (dot-blot trap, co- immunoprecipitation and fluorescent bimolecular complementation). Additionally, the in vitro analysis of PYR1 activity, has suggested that PYR1 is regulated by TRXo1 via redox mechanism. In parallel, we have carried out a study to evaluate the sensitivity to different concentrations of exogenous ABA, of the KO1 and OEX mutants. To do this, we have analyzed stomatic movement and germination capacity. The differences found between the WT genotype and the mutants, suggest that TRXo1 might be participating in the regulation of both processes probably through its interaction with PYR1.
We have also studied stomata, photosynthetic and metabolic responses in the mutants (KO1 and OEX), in order to analyze the effect that the lack and the over-expression of TRXo1 might have on processes affected by stomata function. Lower density of mature stomata in KO1 plants in control and in KO1 and OEX plants in salinity conditions, suggests that TRXo1 could be involved in stomata development. Stomata closure was not affected in the mutants under saline condition in spite of the higher NO and ABA levels. These results, suggest that TRXo1 might be involved in post-translational modifications that could be regulating elements of the ABA perception signaling pathway. Additionally, the differences found in stomata dynamics could be also related to changes in the metabolism produced by the alteration of the TRXo1 levels. Finally, both, metabolic and stomata dynamics differences, do not affect the photosynthetic response, which is similar in the three genotypes.
The objectives achieved in this Doctoral Thesis represent an advance in the study of the physiological and metabolic function of TRXo1, expanding the knowledge of its mitochondrial and nuclear functions. They also demonstrate the involvement of TRXo1 in key processes to adaptation to saline stress, such as stomata development and the response to ABA.
