Resumen de Effects of assisted reproductive technologies and reproductive fluids on phenotypical and epigenetics modifications in bos taurus oocytes, preimplantational embryos and offspring
Jordana Luisa Portugal De Sena Lopes
- español
La infertilidad humana es una enfermedad que ha crecido exponencialmente en los últimos años. Las técnicas de reproducción asistida (TRA) son la solución para muchos problemas de fertilidad tanto en la especie humana como en el mundo animal. Pero, los datos sobre las consecuencias de las TRA no están siendo generados a la misma velocidad a la que se implementan los nuevos procedimientos.
El objetivo de esta tesis doctoral consistió en estudiar el efecto de diferentes TRA y de los protocolos utilizados, cubriendo desde el ovocito hasta la descendencia. En el Capítulo 1, se presenta una breve revisión de la literatura, donde se aborda el problema de la infertilidad tanto en humanos como en animales, así como la historia del desarrollo de las TRA, los protocolos más utilizados actualmente, y, por fin, los problemas que han sido asociados a esas mismas TRA.
El Capítulo 2 resume las hipótesis y objetivos de la tesis doctoral, mientras que el Capítulo 3 incluye el estudio de una de las TRA más utilizadas: la estimulación ovárica controlada (EOC). Nuestra hipótesis sería que el metiloma de los ovocitos sometidos a tratamiento hormonal estaría alterado. Se obtuvieron ovocitos de vacas no-estimuladas a partir de folículos pre-ovulatorios y, posteriormente, los mismos animales fueran estimulados hormonalmente para obtener nuevamente sus ovocitos. Utilizando tecnología de secuenciación masiva, obtuvimos el metiloma individual de los ovocitos y los resultados demostraron que, aunque el metiloma de los ovocitos no-estimulados y estimulados es globalmente muy parecido, existen diferencias específicas en la metilación de islas CpG de determinados genes de impronta y en sus regiones de control.
El Capítulo 4 se ha enfocado al estudio de protocolos de maduración in vitro. Nos planteamos como hipótesis que al añadir el medio natural en el que madura el ovocito (fluido folicular) al medio de cultivo in vitro se incrementaría la competencia del ovocito para dar lugar a un embrión sano. Los ovocitos fueron madurados in vitro utilizando como suplemento fluido folicular bovino (bFF), fluido folicular bovino inactivado por el calor (bFFin) y suero fetal bovino (FBS). Los resultados demostraron los ovocitos de bFF tuvieran una mayor expansión del cumulus oophorus en comparación con los restantes grupos. Tras la fecundación in vitro, el grupo bFFin demostró una menor eficiencia, pero el porcentaje de blastocistos fueron similares entre grupos. Los embriones de los dos grupos experimentales se desarrollaron más rápidamente que los embriones del grupo FBS y presentaron mayor número de células totales. Sin embargo, la mayor calidad embrionaria no fue decisiva a la hora de evaluar la supervivencia pos-vitrificación En el Capítulo 5, embriones producidos in vitro utilizando medios de cultivo embrionario mejorados con la adición de fluidos reproductivos (RF), así como embriones control (con adición de albumina sérica bovina, BSA) fueron obtenidos para nuestros experimentos. Estos embriones fueron vitrificados y almacenados hasta su desvitrificación y transferencia a hembras receptoras sincronizadas. Paralelamente, se estableció un grupo de vacas inseminadas artificialmente (AI) utilizando el mismo toro que había sido utilizado para generar los embriones in vitro (grupos IVP). Las concentraciones hormonales de las receptoras fueron seguidas durante toda la gestación, con la intención de detectar posibles diferencias. Estas diferencias fueron más frecuentes entre los grupos BSA y AI, mientras que el grupo RF obtuvo valores intermedios. Sin embargo, se observó una mayor tendencia a la aparición de problemas en el parto en los grupos IVP así como la mortalidad neonatal ocurrió solo en los grupos IVP.
En el Capítulo 6 estudiamos los terneros obtenidos según describimos en el Capítulo 5 y evaluamos su crecimiento y parámetros hematológicos durante los 30 primeros días de vida. Solo una diferencia de crecimiento fue constante durante el estudio: la altura a la cruz del grupo AI fue siempre superior a los grupos IVP. Los parámetros hematológicos demostraran algunas diferencias aisladas en algunos días, pero esas mismas no se repetían en distintos días. Sin embargo, todos los valores obtenidos se encontraban dentro de los rangos normales esperables para esa edad. Queda aún por entender si estos terneros tendrán alguna diferencia en el desarrollo posterior, ya que podrá ser muy temprano para llegar a conclusiones. Adicionalmente, se realizaron biopsias a estos mismos terneros para detectar algún cambio en el estadio de impronta de algunos genes asociados a síndromes de sobrecrecimiento.
En conclusión, esta tesis demuestra que las TRA están muy lejos de ser el perfecto sustituto a la producción de embriones, desarrollo y nacimiento in vivo. El uso de estimulación hormonal, ampliamente implementado en las clínicas de fertilidad, puede ser la razón de muchas de las alteraciones encontradas en descendencia producida in vivo. La suplementación del medio de maduración puede también ser el punto clave para cambiar la calidad embrionaria in vitro. La descendencia derivada de la producción de embriones in vitro puede tener más dificultades en el parto, pero es muy similar a sus controles in vivo después del nacimiento hasta el primer mes de vida. Es evidente que se necesitan cambios en los protocolos utilizados actualmente y deben realizarse más estudios para entender los efectos de las TRA en la descendencia futura.
- English
Human infertility is a disease that has been growing in large numbers in the past few years. Assisted reproductive technologies (ART) are the solution for many fertility issues in both human and animal world. Everyday new procedures are being developed but data on the consequences of these are not being generated at the same rate as they are being implemented. It is, then, imperative to investigate in this field in order to improve the results and to guarantee the health status of ART resulting offspring.
The aim of this thesis was to study both the effect of the techniques as well as the protocols used, covering from the oocyte to the offspring. In Chapter 1, a brief review on the literature was made, where infertility in both humans and animals was approached, as well as the history of ART development, the most used techniques at the moment and lastly, the problems that have been associated with those ART.
Chapter 2 summarize the main hypotheses and objectives of this thesis, while Chapter 3 embarked on the study of one of the most used ART: controlled ovarian stimulation (COS). We hypothesized that the methylome of oocytes submitted to hormonal stimulation would be altered. Cow oocytes from unstimulated animals were collected from pre-ovulatory stage and later, the same animals were hormonally stimulated to collect the oocytes as well. We performed single cell whole genome sequencing to those oocytes and results showed that, although the methylome of unstimulated and stimulated oocytes was quite similar globally, differences in methylation of specific CpG islands of imprinted genes and imprinting control regions were detected.
Chapter 4 focused on the study of protocols of oocyte maturation in vitro. By adding the natural milieu of the oocyte (follicular fluid), we hypothesized that the oocyte competence would increase. Oocytes were matured in vitro using as supplement bovine follicular fluid (bFF), heat-inactivated bovine follicular fluid (bFFin) and fetal bovine serum (FBS). Results from oocyte competence evaluation showed no difference in nuclear maturation nor cortical granules distribution. However, bFF oocytes showed higher cumulus expansion rate than the other groups. Efficiency of in vitro fertilization of the oocytes showed lower values for bFFin group, but cleavage and blastocyst yield were similar across groups. Both bFF-derived embryos developed faster than FBS embryos and had increased total cell number. Nonetheless, higher quality was not decisive when evaluating embryo survivability post-vitrification.
In Chapter 5, embryos were produced in vitro using culture media improved by reproductive fluids (RF), as well as control embryos (standard protocol, with bovine serum albumin, BSA). These embryos were vitrified and stored until warming and transfer to synchronized recipients. A parallel group consisting of artificial inseminated (AI) cows was created using the same bull as IVP embryos. Hormonal concentrations of pregnant recipients were followed during gestation in order to detect possible differences. These differences were more frequent between BSA and AI group, while RF pregnant group had more intermediate values. However, calving issues were more severe in both IVP groups than in AI, as well as neonatal mortality only happened in the IVP groups.
In Chapter 6, we studied the calves resulting from chapter 5 and evaluated their growth and haematological status during the first 30 days of life. Only one difference in growth parameters was constantly different, which was the height at withers from AI calves being higher than IVP calves. Haematological parameters showed isolated differences in each day, not being repeated in different days. But all animals showed values that are in accordance to expected normal values. However, it is yet to be understood if these calves will have any difference in their development, as it might be too soon to draw conclusions. Additionally, biopsies were made to these calves in order to detect any change in the imprinting status of genes that are involved in the appearance of overgrowth syndromes.
In summary, this thesis has shown that ART are many kilometres away from being the perfect substitute to in vivo embryo production, development and birth. The use of hormonal stimulation that is widely implemented in fertility clinics might be the reason of many alterations found in in vitro produced offspring. The supplementation of maturation medium might also be the key to change the in vitro embryo quality. Offspring derived from in vitro production of embryos might have a tendency to have more difficulties during deliver, but seem particularly similar to their in vivo controls after birth until one month of life. Changes are necessary in current used protocols and studies need to be made to fully understand the effects that ART have on the future offspring.
