Resumen de Short, medium, and long-term behavioral and molecular effects of the preweaning exposure to Chlorpyrifos in Wistar rats

Cristian Antonio Pérez Fernández

• español

  El Clorpirifós (CPF) es uno de los pesticidas Organofosforados (OP) más ampliamente usados tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo. Aunque su importancia en relación con las necesidades humanas es incuestionable, su uso se ha asociado sistemáticamente con multitud de alteraciones conductuales y fisiológicas, así como con la incidencia de muchas patologías psiquiátricas, neurológicas, del neurodesarrollo y neurodegenerativas. A pesar de que el principal mecanismo toxicológico del CPF es la inhibición irreversible de la Acetilcolinesterasa (AChE) en el sistema nervioso central (CNS), muchos autores han encontrado mecanismos moleculares alternativos (p.ej. diferentes componentes dentro del sistema colinérgico y de otros sistemas de neurotransmisión) sin la implicación de la AChE mediante el uso de dosis bajo el rango de inhibición sistémica, definiendo un perfil neuro toxicológico no colinesterásico (NChEI). Este perfil se ha visto eminentemente siguiendo protocolos de exposición durante el desarrollo, cuando el CNS parece ser más sensible a la intoxicación por OP. Sin embargo, las diferentes alteraciones tanto conductuales como fisiológicas inducidas por la exposición durante el desarrollo a dosis NChEI de CPF varían dependiendo del periodo específico del desarrollo, con resultados diferentes o incluso opuestos para variables específicas cuando la exposición acontece durante la gestación (exposición temprana o tardía) o posnatalmente (exposición neonatal o pre deteste). Hoy en día, la edad pre-destete es uno de los periodos del desarrollo menos estudiados. Esto es relevante ya que el CNS de los roderos a esas edades es equivalente al periodo perinatal in términos de desarrollo del CNS en humanos, una edad conocida por ser especialmente sensible a estresores externos, incluyendo agentes químicos presentes en el medioambiente. En base a esto, consideramos que los efectos conductuales y moleculares a corto, medio y largo plazo de la exposición a dosis NChEI de CPF debe ser analizado en mayor profundidad en relación con las edades pre-deteste (desde el día postnatal 10 al 15), usando dosis más bajas (1mg/kg/día) de las que se observan comúnmente en la literatura. Junto a esto, estamos también interesados en el estudio de la existencia de otras moléculas que puedan explicar mecanismos de acción moleculares alternativos de la exposición a CPF. Siguiendo a otros autores, hemos incluido el estudio de ambos sexos ya que los efectos de la exposición a CPF se han observado como dependientes del sexo in relación a multitud de comportamientos. Nuestros resultados principales muestran que la exposición durante la edad pre-destete a dosis NChEI de CPF hipo e hiper sensibilizó el sistema colinérgico y el GABAérgico, respectivamente, una vez dichos sistemas fueron “retados” con drogas específicas. A esto lo acompañó una regulación al alza de los genes tanto del receptor muscarínico 2 como la subunidad α2 del receptor GABA-A en el estriado dorsal y el córtex frontal, respectivamente, durante la adultez temprana. También se observó una importante reducción en la expresión del mRNA del factor neurotrófico derivado del cerebro en el estriado dorsal durante la adultez. La exposición a CPF alteró la motricidad tanto incrementándola (adolescencia) como disminuyéndola (adultez y adultez tardía) evaluado mediante diferentes medidas locomotoras, así como hipersesibilizó las hembras ante estresores (siguiendo una inyección i.p. de salino) durante la adolescencia. La exposición a CPF no afectó ni a la sociabilidad (adolescencia y adultez) ni a la dominancia (adultez), así como tampoco alteró el estado basal de los procesos atencionales, el control inhibitorio, la memoria/aprendizaje espacial o la ansiedad. Sin embargo, las hembras expuestas mostraron un nivel de aprendizaje mejorado durante la adultez en tareas reguladas por la atención sostenida, algo no observado en edades más avanzadas en tareas de memoria espacial, así como los animales expuestos mostraron un aumento de su impulsividad motora, descubierto cuando ciertas contingencias contextuales fueron manipuladas (aumento del intervalo inter-estímulo en la tarea de 5-choice serial reaction time). Junto a estos datos conductuales, farmacológicos y de expresión genética, la exposición CPF también indujo una disbiosis intestinal tanto a medio (adolescencia) como a largo plazo (adultez) con relación a multitud de bacterias tanto a nivel de género como de especies. La exposición a CPF también alteró la composición de metabolitos plasmáticos induciendo un perfil hiperlipídico, hipoglicémico, y un aparente descenso en la producción de energía celular exclusivamente en las hembras en edad adulta. Todos estos datos empíricos derivados de la presente tesis doctoral son nuevos y relevantes con relación al protocolo de exposición usado, completamente nuevos en relación con la exposición a CPF independientemente de la edad de exposición o, incluso, en relación con la exposición a CPF en cualquier edad. Sin embargo, las investigaciones futuras deberían incluir un análisis en profundidad de los diferentes componentes del sistema colinérgico de GABAérgico, tanto a nivel farmacológico como molecular, enfatizando la necesidad de analizar a nivel de expresión proteica en conjunción con medidas de expresión de mRNA. La base fisiológica de los diferentes comportamientos motores e impulsivos también deben ser explorados en mayor profundidad.

• English

  Chlorpyrifos (CPF) is one of the most widely used Organophosphate pesticides (OP) in both developed and developing countries. Although its importance FOR human needs is unquestionable, its use has been systematically linked with several specific behavioral and physiological alterations, as well as with the incidence of numerous psychiatric, neurologic, neurodevelopmental, and neurodegenerative disorders. Even though the main mechanism of toxicology of CPF is the irreversible inhibition of Acetylcholinesterases (AChE) in the central nervous system (CNS), several authors have found alternative molecular targets (e.g., different components within the cholinergic system and from other neurotransmitter systems) without the implication of AChE by using doses wellbellow the range of systemic inhibition, defining a non-cholinesterase profile of neurotoxicology (NChEI). Interestingly, this profile has primarily been observed following developmental exposure protocols when the immature CNS appears to be more sensitive to OP intoxication. However, the different behavioral and physiological alterations induced by developmental exposure to NChEI doses of CPF can vary depending on the specific developmental stage, with different or opposing results for a specific variable according to whether the exposure occurs during gestation (early vs. late ages) or postnatally (neonatal vs. preweaning exposures). To date, preweaning ages are one of the least studied developmental periods. This is relevant, since the CNS of rodents at these ages is equivalent to the perinatal CNS in humans in developmental terms, an age known to be particularly sensitive to external stressors, including environmental chemicals. Based on this, we considered that the short, medium and long-term behavioral and molecular effects of exposure to NChEI doses of CPF must be analyzed in more depth, particularly at preweaning ages (Postnatal day 10 to 15) and using lower doses (1mg/kg/day) than those commonly reported in the current literature. In addition to this, we were also interested in studying the existence of other molecular targets that could explain the alternative mechanism of actions of CPF exposure. Following other authors, we also included both sexes, since the effects of CPF exposure have been shown to be sex-dependent for a multitude of behaviors. Our main results indicate that preweaning exposure to NChEI doses of CPF hypo and hypersensitized the cholinergic and the GABAergic systems, respectively when challenged with specific drugs. This was also accompanied by the up-regulation of both the muscarinic 2 receptor and the GABA-Aα2 subunit receptor genes in the dorsal striatum and the frontal cortex, respectively, during early adulthood. A significant decrease in the mRNA expression of the brainderived neurotrophic factor was also found at the dorsal striatum during adulthood. CPF exposure altered motricity by both increasing (adolescence) and decreasing (adulthood and late-adulthood) various locomotor outcomes, and also hypersensitized females to stressors (following an i.p. injection of saline) during adolescence. CPF exposure had no effect on sociability (adolescence and adulthood) or dominance (adulthood), whilst it did not alter basal attention (adulthood), inhibitory control (adulthood), spatial learning/memory (late-adulthood) skills or anxiety state. However, exposed females showed enhanced learning during adulthood in sustained attention-based tasks, which was not observed later in aging rats in spatial-memory-based mazes, whilst the exposed animals showed increased impulsive action behaviors, which were revealed when the contextual contingencies were manipulated (increasing the inter-trial interval in the 5- choice serial reaction time task). In addition to these behavioral, pharmacological, and brain gene expression effects, CPF also induced both medium (adolescence) and longterm (adulthood) gut dysbiosis involving several bacteria at both genus and species levels.

  CPF exposure also altered the levels of numerous plasma metabolites by inducing a longterm (adulthood) hyperlipidemic, hypoglycemic, and an apparent decreased cell energy production exclusively in adult female rats. All of the empirical data derived from the present doctoral thesis is novel and relevant with regard to the exposure protocol used, completely new regarding the exposure to CPF at any developmental stage, or even the exposure to CPF at any moment of the life-span. However, future research concerning this exposure protocol should include a more in-depth analysis of components of the cholinergic and GABAergic systems, at the both pharmacological and molecular levels, and we emphasize the necessity to analyze the protein expression level along with mRNA outcomes. The physiological basis of the different motoric and impulsive-like behaviors should also be further explored.