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Resumen de La panoplia de Brucella: búsqueda de efectores del Sistema de Secreción de Tipo IV y caracterización de inhibidores de lisozima

Yelina Ortiz Pérez

  • español

    Los organismos del género Brucella son cocobacilos gram negativos responsables de la brucelosis. Esta enfermedad puede afectar a varias especies animales, así como a humanos. De hecho, la brucelosis es una de las principales zoonosis a nivel mundial, con más de 500.000 casos reportados anualmente (Pappas et al., 2006) y posiblemente infradiagnosticada unas 4-5 veces. La enfermedad en humanos es causada principalmente por 4 especies del género: B. melitensis, B. suis, B. abortus y B. canis.

    Tras la invasión, Brucella es fagocitada por fagocitos profesionales como macrófagos, monocitos, neutrófilos y células dendríticas, y también por muchas células epiteliales, así como por trofoblastos. Sin embargo, Brucella no es capaz de replicar en alguna de estas células. En términos generales, tras la fagocitosis Brucella es contenida en BCVs que van a interaccionar con la vía endocítica, incluyendo endosomas tempranos y tardíos, y lisosomas, produciendo la acidificación de la vacuola que se convertirá en eBCVs. Esta acidificación, junto con la baja disponibilidad de nutrientes, van a hacer que se exprese el T4SS (Boschiroli et al., 2002). A continuación, las eBCVs en su viaje hasta el ER van a ir perdiendo marcadores endosomales y adquiriendo marcadores específicos del ER formando las rBCVs, donde Brucella se replicará. Además, estas vacuolas pueden interaccionar con el tráfico vesicular entre el ER y el Golgi (Sedzicki et al., 2018; Celli, 2019). Tras la replicación, las rBCVs son capturadas dentro de estructuras como autofagosomas de manera dependiente del T4SS, llamándose en este momento aBCVs. Este proceso va a ayudar a Brucella a escapar de la célula infectada, liberándose al medio y pudiendo infectar otras células.

    Como vemos, el T4SS es un factor de virulencia clave para Brucella. Los T4SS son una familia de sistemas de secreción bacterianos con una alta plasticidad, ya que son capaces de translocar tanto proteínas, ADN como peptidoglicano (Christie et al., 2014). En el caso específico de Brucella este sistema de secreción es clave para la infección de células eucariotas. De hecho, el T4SS de Brucella es necesario tanto al inicio como al final de su ciclo intracelular (Hanna et al., 2011; Sá et al., 2012; Smith et al., 2016). Además, se sabe que este sistema de secreción es capaz de secretar efectores a las células hospedadoras, pudiendo tener un papel fundamental favoreciendo la infección. En comparación con otros patógenos intracelulares, como Legionella o Coxiella, donde se han identificado cientos de efectores (Zhu et al., 2011; Weber et al., 2016), en Brucella únicamente se han identificado 15 efectores secretados por el T4SS (de Barsy et al., 2011; de Jong et al., 2008; Döhmer et al., 2014; Marchesini et al., 2011; Myeni et al., 2013; Salcedo et al., 2013). Además, mediante la búsqueda de estos efectores secretados a través del T4SS, se identificaron otros 7 efectores secretados a la célula hospedadora de manera independiente de su T4SS (Marchesini et al., 2011; Myeni et al., 2013). Estos efectores fueron propuestos como candidatos a ser proteínas secretadas por el T4SS en base a diversos métodos. Algunos autores estudiaron las proteínas que poseían una región conservada en el promotor para la activación por VjbR, una secuencia también presente en el promotor de VirB (de Jong et al., 2008); mientras que otros determinaron interacciones con proteínas del hospedador necesarias para la bacteria durante la infección (de Barsy et al., 2011), entre otras cosas. Además, la determinación de estos efectores como proteínas secretadas se ha llevado a cabo por varios métodos convencionales como son los ensayos CyaA y TEM1, así como por immunofluorescencia. Sin embargo, estos métodos de selección de candidatos y comprobación de los mismos no han sido demasiado eficientes para la búsqueda de efectores de Brucella, ya que no siempre han sido capaces de identificar proteínas secretadas por Brucella, ya sea de forma dependiente o independiente de su T4SS. Por ello, es lógico pensar que nuevas estrategias para detectar efectores de Brucella pueden identificar nuevas proteínas efectoras.

    La familia Flaviviridae está compuesta de virus pequeños con envuelta de cadena positiva de RNA, cuya replicación depende completamente de la célula hospedadora. Estos virus usan maquinaria especializada para fusionar la membrana del virus con las membranas del hospedador a través de la vía endosomal. Tras la internalización, se van a replicar y salir de la célula hospedadora manipulando varias membranas del hospedador, principalmente ER, Golgi y vesículas autofágicas (Fernandez-Garcia et al., 2009; Gerold et al., 2017; Ke, 2018; Arakawa and Morita, 2019). Esta dependencia por las membranas del hospedador recuerda al ciclo intracelular de muchas bacterias intracelulares como es el caso de Brucella. Por lo que se puede pensar que los efectores de Brucella que afecten a funciones del huésped para favorecer su supervivencia intracelular, puedan interferir con el ciclo biológico de estos virus, al compartir dianas y nichos.

    Uno de los mecanismos más ancestrales de defensa contra las bacterias desarrollado por los organismos eucariotas es la producción de lisozima (Callewaert and Michiels, 2010). En mamíferos, esta proteína es producida por la mayoría de las células fagocíticas del sistema inmune innato, incluyendo neutrófilos, macrófagos, monocitos y células dendríticas (Klüter et al., 2014; Ragland and Criss, 2017), aunque también se puede encontrar en muchas otras secreciones del cuerpo como lágrimas, salivas e incluso en plasma sanguíneo (Lehrer, 1998), así como en muchos tejidos incluyendo el tracto intestinal y respiratorio (Callewaert and Michiels, 2010). La lisozima es capaz de hidrolizar los enlaces β-(1-4) glicosídicos del peptidoglicano (Callewaert et al., 2008), uno de los principales componentes de la pared celular de las bacterias. Sin embargo, las bacterias han sido capaces de desarrollar una serie de mecanismos de resistencia frente a la lisozima. Una de las últimas estrategias identificadas contra la acción de la lisozima es la producción de inhibidores de lisozima. Sin embargo, en el caso de Brucella, poco se sabe acerca de cómo es capaz de resistir a la acción de la lisozima. De hecho, es posible que Brucella tenga una capacidad intrínseca para resistir a la lisozima gracias a la composición de su membrana celular que le confiere una baja permeabilidad a los péptidos catiónicos como la lisozima o lactoferrina (Tejada et al., 1995). Sin embargo, recientemente se ha visto como cuando se mutan ciertas proteínas esenciales para la estabilidad de la membrana celular de Brucella, como MapB, la sensibilidad de estas bacterias a la lisozima aumenta, aunque esta no es total (Bialer et al., 2019).

    Brucella es capaz de sobrevivir y replicar dentro de las células del huésped. Sin embargo, este fenómeno clave para la patogenicidad de Brucella no sería posible sin el desarrollo de una serie de mecanismos que permiten a la bacteria enfrentarse a las adversidades con las que se encuentra dentro del hospedador. Esta tesis tiene por tanto el objetivo de estudiar dos mecanismos que podría haber desarrollado Brucella para favorecer su supervivencia y con ello la infección: los efectores del T4SS y los inhibidores de lisozima.

    Búsqueda de nuevos efectores del T4SS de B. abortus En esta primera parte, se quería llevar a cabo una búsqueda de nuevos efectores de Brucella a través de la interacción con la replicación de virus de la familia Flaviviridae. Para ello inicialmente se utilizaron varios software publicados para la predicción de efectores secretados a través del T4SS (Meyer et al., 2013; Zou et al., 2013; Wang et al., 2014, 2017), con el fin de reducir el número de candidatos. Sin embargo, se vio que ninguno de estos métodos de predicción era totalmente eficaz, ya que ninguno de ellos era capaz de predecir como candidatos a los 15 efectores de Brucella secretados a través de su T4SS descritos hasta la fecha. Además, existía mucha heterogeneidad entre los candidatos predichos por cada método. Algo que tampoco resultó especialmente sorprendente, ya que cada uno de ellos analiza conjuntos de características de las proteínas diferentes (Meyer et al., 2013; Wang et al., 2017, 2014; Zou et al., 2013). Además, también se incluyeron proteínas anteriormente descritas en la bibliografía como candidatos. Así se generó una lista de 256 proteínas de B. abortus candidatas a ser efectores secretados por su T4SS. De estas 256 proteínas se seleccionaron 151 según varias características: efectores reales secretados por el T4SS; proteínas secretadas independientemente al T4SS; la mayoría de las proteínas predichas por el S4TE software (Sankarasubramanian et al., 2016), así como proteínas predichas como candidatas por varios métodos; proteínas hipotéticas e incluso se incluyeron algunas proteínas con función conocida.

    Así, mediante una estancia en la Universidad de Yale, en el laboratorio del Dr. Lindenbach, se puso a punto el ensayo y se probó para los primeros 21 efectores, donde se incluyeron 14 efectores de Brucella secretados a través de su T4SS y 7 proteínas de Brucella secretadas de forma independiente a su T4SS. Para ello, los genes que codifican para esas proteínas se clonaron mediante una reacción Gateway primero en el vector pDONR223 y finalmente en un vector lentiviral que expresaba una proteína roja constitutivamente, IRF670. Estos vectores lentivirales se utilizaron para generar partículas lentivirales que se usaron para expresar cada candidato en células eucariotas bajo el control de un promotor inducible. Así, las células que se encontraban expresando estas proteínas fueron infectadas con partículas infectivas de YFV y HCV. Mediante este primer ensayo se vio como los niveles de infección de YFV eran más heterogéneos cuando las células expresaban las diferentes proteínas de B. abortus; mientras que la expresión de estas proteínas siempre disminuía los niveles de infección de HCV. Sugiriendo que quizás YFV es un mejor candidato para llevar a cabo el cribado de efectores. Por otro lado, se vio que los efectores BAB1_0279 y BAB1_0756, además de ser los que presentaban mayor inhibición sobre la replicación viral, son tóxicos para las células. Esta actividad citotóxica ha sido también descrita recientemente, y se ha asociado con los dominios TIR presentes en estas proteínas (Coronas-Serna et al., 2019).

    Tras este análisis inicial, el ensayo se completó con las restantes 130 proteínas seleccionadas. Para ello, el método de análisis fue adaptado a los medios de los que disponíamos en nuestro laboratorio. Así, los genes que codifican para estas proteínas se clonaron en un vector lentiviral que expresaba constitutivamente m-Cherry. Paralelamente, se intentaron generar partículas virales de YFV y HCV. Sin embargo, mientras que para YFV se obtuvieron bastantes partículas infectivas para llevar a cabo el ensayo, fue imposible generar partículas infectivas de HCV. De este modo, el ensayo únicamente se llevó a cabo con YFV. Tras el análisis global de los 151 candidatos, se encontraron varios candidatos que aumentaban o disminuían los niveles de infección de YFV. Entre las proteínas de B. abortus que favorecían la infección de YFV estaban: BAB2_0074, BAB2_0271, BAB1_0608, BAB1_0740, BAB1_1199, BAB2_0773, BAB1_1344 y BAB2_0246. Mientras que BAB1_0817, BAB1_1322, BAB1_1730, BAB1_1185, BAB1_1386, BAB1_1396, BAB2_0634, BAB1_0279 y BAB1_0756 disminuían la infección de YFV, incluso por niveles inferiores al control de inhibición IRF1.

    En conjunto, estos resultados sugieren que hay algunas proteínas de B. abortus que podrían ser efectores secretados por su T4SS de acuerdo con la predicción de varios programas que son capaces de modificar la infección del YFV. Sin embargo, estos resultados aún son preliminares y más ensayos son necesarios para concluir si estas proteínas están efectivamente haciendo algo en la célula hospedadora que afecta a la replicación de los virus de la familia Flaviviridae, y para determinar si estas proteínas efectivamente son efectores de Brucella secretados a través de su T4SS.

    Caracterización de posibles inhibidores de lisozima de B. abortus En esta segunda parte, estudiamos el papel de dos posibles inhibidores de lisozima presentes en B. abortus, BAB1_0102 y BAB1_0466, previamente identificados en nuestro laboratorio. BAB1_0466 había sido cristalizada unida a lisozima (Um et al., 2013). Mientras que BAB1_0102 fue re-anotada tras un estudio realizado por nuestro grupo, y esta re-anotación estableció un nuevo inicio de la transcripción y una proteina de menor tamaño, que resultó ser homóloga a otros inhibidores de lisozima. Se realizaron varios análisis in silico que determinaron que estas proteínas contenían el dominio MliC de inhibidores de lisozima. El dominio MliC de BAB1_0466 contiene los residuos conservados de lisina y serina necesarios para la interacción con la lisozima, mientras que el dominio MliC de BAB1_0102 no.

    Teniendo estos dos candidatos, inicialmente se llevaron a cabo estudios in vitro para determinar la actividad de BAB1_0102 y BAB1_0466 como posibles inhibidores de lisozima. De este modo se demostró que BAB1_0466 es un homólogo funcional de los inhibidores de lisozima MliC/PliC en B. abortus, aunque todavía se desconoce su localización. Sin embargo, la proteína BAB1_0102 re-anotada no es capaz de inhibir la actividad de la lisozima. Además, se ha intentado ver la actividad de estas proteínas como inhibidores de otras proteínas con actividad tipo lisozima presentes en B. abortus, como SagA. Sin embargo, en nuestras condiciones ninguna de estas proteínas es capaz de inhibir la actividad lítica de SagA. Recientemente se ha visto como la proteína completa de BAB1_0102, no la re-anotada, es capaz de inhibir la acción de SagA mediante otros ensayos diferentes (Del Giudice et al., 2019). Estos datos hacen pensar que quizás la proteína completa de BAB1_0102 sea necesaria para obtener una estructura adecuada para la interacción con SagA, o que el ensayo que se ha utilizado aquí no sea suficientemente sensible como para detectar esta actividad.

    Tras comprobar la actividad de BAB1_0466 como inhibidor de lisozima se quiso determinar el papel que jugaba esta proteína en la supervivencia de Brucella cuando la lisozima estaba presente en el medio. Para ello, inicialmente, se utilizaron cepas de B. abortus WT, un mutante 2308Δ0466, y este mismo mutante al que se le había insertado un plásmido de expresión que contenía la proteína BAB1_0466. Sin embargo, cuando estas cepas fueron tratadas con lisozima no se vieron diferencias entre el mutante 2308Δ0466 y el WT. Esto, posiblemente se debiese a que la membrana externa de Brucella es bastante impermeable a los péptidos catiónicos como es la lisozima (Tejada et al., 1995). Por ello, para intentar hacer a B. abortus más sensible a la acción de la lisozima, las bacterias se trataron además de con lisozima con glicina (Ralston et al., 1961). Con ello vimos, que, aunque B. abortus era más sensible a la acción de la lisozima, seguía sin haber diferencia entre el mutante 2308Δ0466 y el WT. Finalmente, dado que se había descrito que la ausencia de MapB desestabilizaba la membrana de Brucella haciendo a la bacteria más sensible a la acción de la lisozima (Bialer et al., 2019), se quiso comprobar si existía una diferencia en la supervivencia de B. abortus entre el mutante 2308ΔmapB y el doble mutante 2308Δ0466ΔmapB. De este modo, se vio que efectivamente, la ausencia de MapB aumentaba la sensibilidad de B. abortus a la acción de la lisozima. Aunque no se pudo ver una diferencia significativa entre el mutante simple en mapB y el doble mutante sin inhibidor de lisozima, se vio que cuando se complementaba éste último con BAB1_0466, las bacterias restablecían su supervivencia a niveles similares a los del WT. Podemos concluir que BAB1_0466 inhibe la acción de la lisozima, jugando un papel importante en la supervivencia de B. abortus cuando ésta tiene comprometida su envuelta celular.

    Finalmente, se quiso determinar el papel que podía jugar esta proteína durante la infección en células humanas. Como se ha dicho las células fagocíticas producen grandes cantidades de péptidos antimicrobianos como defensinas que desestabilizan la membrana externa ayudando a la acción de la lisozima (Hancock et al., 1981; Sawyer et al., 1988; Hancock and Scott, 2000). Inicialmente se llevaron a cabo infecciones con B. abortus en macrófagos de ratón, el modelo por excelencia usado en infecciones con Brucella. Sin embargo, aunque se pudo observar la curva típica de supervivencia, no se detectó ninguna diferencia en la supervivencia entre el mutante 2308Δ0466 y el WT. El siguiente paso fue realizar infecciones de sangre completa con B. abortus. En este caso se pudo ver que la pérdida de BAB1_0466 reducía significativamente la supervivencia de B. abortus. Esto indica que es posible que haya alguna célula fagocítica en la sangre que es capaz de matar más eficientemente a B. abortus en ausencia del inhibidor de lisozima BAB1_0466.

    Para intentar determinar la población responsable de la disminución de la supervivencia de B. abortus se probaron distintos tipos celulares: neutrófilos humanos, monocitos y macrófagos humanos, y únicamente se pudo ver una diferencia significativa entre el mutante 2308Δ0466 y el WT en células HL-60 tratadas con DMF, que supuestamente determina su diferenciación hacia neutrófilos. Sin embargo, tras el análisis por citometría de flujo, se vio que estas células en vez de corresponder con una población de neutrófilos, se diferenciaban a tres poblaciones distintas bastante heterogéneas. De hecho, únicamente se pudieron clasificar dos poblaciones, una de ellas poseía un fenotipo como monocitos/macrófagos y la otra de ellas eran células en un estadio anterior de diferenciación, posiblemente promonocitos. La tercera población obtenida era tan heterogénea que no se pudo clasificar en un tipo celular determinado. Tras estos resultados se intentó ver si los monocitos/macrófagos humanos eran los responsables de esta diferencia en la supervivencia del mutante 2308Δ0466. Cuando se llevó a cabo el ensayo con células THP-1 se pudo ver una diferencia, aunque no significativa entre la supervivencia del mutante 2308Δ0466 y el WT, y cuando se complementaba el mutante 2308Δ0466 con BAB1_0466 si se pudo ver una diferencia significativa entre el mutante 2308Δ0466y la cepa de complementación. Lo que nos hace pensar que, como ocurría cuando se usaban los distintos mutantes en 2308ΔmapB, BAB1_0466 es capaz de inhibir la acción de la lisozima producida por monocitos cuando esta proteína se está expresando a niveles superiores a los basales.

    Estos datos en conjunto sugieren que BAB1_0466 es un inhibidor de lisozima, que desempaña un papel importante en la supervivencia de Brucella cuando ésta tiene la OM dañada. Además, todo parece indicar que esta proteína juega un papel importante en la supervivencia de la bacteria durante la infección, especialmente durante la infección de monocitos. Aunque hacen falta más datos que confirmen esta hipótesis, así como determinar el papel que juega esta proteína en la virulencia de la bacteria en infecciones in vivo.

    Conclusiones 1. Ninguno de los métodos existentes para la predicción de efectores bacterianos es totalmente efectivo para la predicción de efectores del T4SS de Brucella.

    2. Hemos establecido un nuevo método de cribado de efectores basado en un ensayo de interferencia con la replicación del YFV. Este método podría ser aplicado a cualquier librería de potenciales efectores que pudiesen estar afectando a rutas intracelulares comunes con las utilizadas por el YFV.

    3. El cribado de una librería de 151 efectores candidatos de B. abortus por este ensayo mostró que la replicación del YFV se ve incrementada en presencia de las proteínas BAB2_0074, BAB2_0271, BAB1_0608, BAB1_0740, BAB1_1199, BAB2_0773, BAB1_1344 y BAB2_0246; mientras que disminuye en presencia de BAB1_0817, BAB1_1322, BAB1_1730, BAB1_1185, BAB1_1386, BAB1_1396, BAB2_0634, BAB1_0279 y BAB1_0756.

    4. El genoma de B. abortus codifica dos posibles inhibidores de lisozima, de acuerdo con la predicción de su homología con el dominio MliC. El dominio MliC de BAB1_0466 contiene los residuos conservados de lisina y serina necesarios para la interacción con la lisozima, mientras que el dominio MliC de BAB1_0102 no.

    5. La proteína purificada BAB1_0466 inhibe la actividad lítica de las lisozimas de la clara de huevo de gallina y humana, mientras que BAB1_0102 no inhibe su actividad.

    6. Las proteínas purificadas BAB1_0466 y BAB1_0102 no inhiben la actividad lítica de la proteína similar a lisozima, SagA.

    7. B. abortus es intrínsecamente resistente a la acción lítica de la lisozima, únicamente se observa dicha acción tras la desestabilización de la membrana externa por la ausencia de la proteína MapB.

    8. En la ausencia de MapB, la proteína BAB1_0466 inhibe la actividad lítica de la lisozima in vivo.

    9. BAB1_0466 es necesaria para la supervivencia de B. abortus durante la infección de sangre completa.

    10. Un mutante por deleción de bab1_0466 de B. abortus muestra unas tasas de supervivencia reducida en una línea celular de monocitos humanos, mientras que su supervivencia no se ve afectada ni en neutrófilos purificados de sangre ni en líneas celulares de macrófagos humanos o de ratón.

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  • English

    Brucella is an intracellular pathogen which has developed some mechanisms to face the adversities found inside the host. Among all the mechanisms of Brucella, we centered our study on the translocation of effector proteins to subvert the host cell and the inhibition of the host lysozyme activity. We have set up a new effector screening method based on assaying the interference with replication of the YFV. The screening showed 8 Brucella proteins that upregulate YFV and other 9 proteins that downregulate YFV. Moreover, it was showed that the Brucella protein named BAB1_0466 inhibits the lytic activity of lysozyme and is necessary for Brucella abortus survival in whole blood. In fact, BAB1_0466 could be important for B. abortus survival inside monocytes.


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